Año 16, 4otrimestre 1999
Cubierta: Cartel de J.M. Subirachs con motivo de la XVII Setmana del Cava

ARTÍCULO

Centro de Investigación y Desarrollo del CSIC. Barcelona.

El Penedès is the major sparkling wine producing region in Spain. Over four consecutive years, from 1993 to 1996, we collected yeast strain samples from spontaneous fermenting musts from el Penedès. These samples were taken from musts of the three traditional grape varieties from el Penedès called macabeu, xarel·lo and parellada. The samples were also taken at different fermentation densities and from different points of the tanks.

La fermentación alcohólica en sentido amplio es la transformación de una molécula de azúcar, básicamente glucosa o fructosa, en dos moléculas de etanol, con la consiguiente producción de energía en forma de ATP y la liberación de CO₂ y de calor. Teniendo en cuenta que esta sería la reacción principal, durante el proceso de fermentación se dan multitud de reacciones necesarias para el desarrollo de las levaduras.

El cava es el producto resultante de una doble fermentación alcohólica. En primer lugar, el mosto pasa a vino en el que se llama primera fermentación o vinificación, que consiste en el consumo de todos los azúcares presentes en el mosto. Respecto a la segunda fermentación, consiste en la adición de sacarosa y levaduras al vino que, después de ser embotellado, fermentará dentro de la botella con el consiguiente aumento de la presión por la acumulación del CO₂.

En el caso concreto de la segunda fermentación, la adición de levaduras es obligatoria, ya que la microflora del vino es muy pobre y no siempre la más adecuada. Por eso, en la segunda fermentación del cava se utilizan levaduras comerciales especialmente seleccionados para llevar a cabo este proceso con la máxima eficacia. Estas levaduras comerciales han de tener una serie de características para funcionar de forma óptima. Algunas características serian:

• Tolerancia elevada al etanol, ya que es el producto principal de la primera fermentación y por esto está en cantidades de hasta el 11% (v/v) en el vino.

• Capacidad fermentativa y rendimiento fermentativo elevados para fermentar con rapidez la totalidad de los azúcares añadidos en el vino.

• No producción de sustancias que puedan disminuir la calidad organoléptica del cava (como el ácido acético o ácido sulfhídrico) y producción de cantidades considerables de sustancias que puedan aumentarse la calidad (como el glicerol o sustancias aromáticas).

• Tolerancia de concentraciones elevadas de CO₂ (de hasta a 6 bar de presión), en pH bajos (de hasta en 2,8) y en la falta de oxígeno y de nutrientes del medio.

Las levaduras asociadas a la industria vínica pertenecen mayoritariamente al género Saccharomyces, que se caracteriza por su capacidad de fermentar vigorosamente, en condiciones anaeróbicas, diferentes azúcares con D-glucosa, D-fructosa o D-manosa, entre otros, para producir etanol y dióxido de carbono.

Los objetivos de este trabajo han sido los siguientes:

• Obtención de colecciones de cepas de levaduras de mosto en fermentación espontánea, con una variabilidad máxima, que servirán de fuente para hacer selecciones.

• Identificación de las cepas de levaduras presentes en las colecciones a través de marcadores moleculares y estudiar su variabilidad de acuerdo con diferentes parámetros de los muestreos.

• Desarrollo de varios sistemas de selección de cepas de levaduras, a partir de las muestras de mosto, para encontrar aquellos sistemas que permitan escoger las cepas óptimas para la segunda fermentación del cava.

• Pruebas de las cepas seleccionadas para cava en tirajes semiindustriales para demostrar su validez.

• Caracterización genética de las cepas seleccionadas, para conocer mejor estas cepas y valorar sus posibilidades de mejora genética.

Los muestreos se realizaron a partir de mostos en fermentación espontánea durante cuatro cosechas consecutivas, desde 1993 hasta 1996. En casi todas las cosechas, se cogieron muestras de las tres variedades de uva autóctona del Penedés, es decir, macabeu xarelo y parellada. El volumen de los depósitos de muestreo osciló entre 2,5 y 1000 litros, de manera que no pudimos observar que la variabilidad de cepas de levadura fuera mayor en depósitos más grandes. Algunas fermentaciones se hicieron con mostos deburbados y otros con el mosto intacto, aspecto que tampoco incidió en la variabilidad de cepas de levaduras. La temperatura de fermentación fue de 18ºC en los depósitos de 10000 litros y a temperatura ambiente (entre 25 y 30ºC) en los depósitos más pequeños.

De cada una de las fermentaciones se obtuvieron entre dos y nueve muestras, tomadas en diferentes estadios de fermentación y de diferentes puntos de los depósitos. Las muestras se cogieron en tres fases de fermentación: una muestra a media fermentación (densidad entre 1020 y 1030 g/L), otra a tres cuartos de fermentación (densidad entre 1004 y 1012g/L) y una muestra al final de la fermentación (densidad de 995 g/L). Las muestras se cogieron a la vez de dos puntos de los depósitos: una muestra de la superficie del mosto y otra del interior a través de un grifo. De cada una de estas fermentaciones se aislaron alrededor de 30 cultivos puros de levadura.

Para identificar las cepas aisladas del mosto se probó tres de los marcadores moleculares usados en la identificación de cepas de levadura. En primer lugar, se probó el patrón de proteínas solubles totales, marcador que no permitió detectar diferencias entre las cepas de levadura de mosto del Penedés. En segundo lugar se probó el patrón de restricción del mtDNA, que consiste en una separación por electroforesis convencional en gel de agarosa de los fragmentos de DNA total generados por digestión con enzimas de restricción del tipo Rsal, Hinfl o Taql. El patrón de restricción del mtDNA sí que permitió detectar diferencias importantes entre las cepas del Penedés. De los tres enzimas de restricción usados, Hinfl es el que permitió detectar más variabilidad entre las cepas aisladas. El patrón de mtDNA también permitió diferenciar las cepas del Penedés de las cepas comerciales. Finalmente, se probó el cariotipo por electroforesis de campo pulsante. A pesar que la interpretación de los cariotipos no es fácil, pudimos observar que las cepas con el mismo patrón de mtDNA podían ser diferenciadas a través del cariotipo. Por tanto el cariotipo fue el marcador molecular que mostró más variabilidad entre las cepas del Penedés.

En este trabajo se ha usado el patrón de mtDNA como marcador para realizar un estudio de la variabilidad natural presente en las cepas del Penedés, ya que es el marcador más fácil de interpretar y más sencillo de llevar a cabo. En todos los casos el patrón de mtDNA se ha realizado con el enzima Hinfl, ya que fue el enzima de restricción que mostró más variabilidad. El cariotipo, en cambio, se ha usado como criterio de clonidad y como medida de inestabilidad genética. En este estudio, el patrón de proteínas totales fue descartado.

Se analizó el patrón de mtDNA de un total de 306 clones independientes aislados a partir de los mostos del Penedés en fermentación espontánea de todas las cosechas de la muestra. De estos 306 clones, 227 pertenecieron al género Saccharomyces, y entre éstos se encontraron 49 patrones de mtDNA diferentes. Entonces, la variabilidad de patrones de mtDNA entre estas cepas fue elevada. Los 29 clones restantes no pertenecientes al género Saccharomyces podrían pertenecer al grupo de las levaduras apiculadas, debido a su típica morfología ojival y al hecho de que aparecen frecuentemente en fermentaciones vínicas no inoculadas.

La distribución de los patrones de mtDNA mayoritarios de los 306 clones aislados agrupados por cosechas (tabla 1) muestra que hubo una evolución temporal de los patrones de mtDNA con el paso de los años, de manera que en cada cosecha van apareciendo patrones de mtDNA nuevos, que tuvieron un tiempo de permanencia y que, en la mayoría de casos, acabaron desapareciendo. La excepción de esto fue el patrón C2, que apareció todos los años en proporciones superiores al 15%. Estas diferencias en la distribución de patrones de mtDNA a lo largo de los años podría ser debida a diferencias en la microflora presente en la uva o en las instalaciones, o bien en las diferencias de las condiciones climáticas de cada cosecha. En esta tabla observaremos también que la aparición de la cepa comercial IOC fue, en general, baja durante todas las cosechas.

La distribución de estos mismos 306 clones agrupados por variedades de uva también mostraron diferencias, pero no tan claras como en el caso de las cosechas. Estas diferencias de distribución de patrones de mtDNA podrían responder a diferencias en la composición de los mostos de estas tres variedades de uva.

A partir de 71 clones aislados de mosto de 1993 se estudió la distribución de patrones de mtDNA de las muestras extraídas de la superficie y la mitad de los depósitos. En este caso, las diferencias de distribución fueron menos claras aún, siendo estadísticamente significativas.

La distribución de patrones de mtDNA de los 86 clones aislados de mosto de 1993 no dio diferencias estadísticamente significativas entre las tres densidades sometidas a muestra.

A partir del análisis estadístico de cada una de las distribuciones, podemos concluir que la cosecha fue el parámetro de muestreo que más diferencias dio entre las distribuciones de patrones de mtDNA de los años muestreados. En segundo lugar, la variedad de uva dio también diferencias importantes en la distribución de patrones de mtDNA entre las variedades de uva macabeu, xarel·lo y parellada. El punto de muestreo dio diferencias significativas entre las muestras de la superficie y del medio de los depósitos, pero a un nivel muy bajo. Finalmente la densidad de muestreo no dio diferencias significativas entre las muestras de diferentes fases de fermentación.

Se desarrollaron cuatro sistemas de selección de cepas de levaduras por elaboración de cava: la selección-1 sería la que se originó por la propia fermentación del mosto antes de hacer los muestreos, ya que el mosto estaba, como mínimo, a mitad de fermentación en el momento en que se tomaron las muestras. De este punto se analizaron 306 clones que hemos descrito en el apartado anterior. La selección-2 se hizo a temperatura elevada, ya que se realizó cultivando en vino las muestras iniciales de mosto a una temperatura de 30ºC. Es importante destacar que el efecto tóxico del etanol aumenta al aumentar la temperatura. La selección-3 la llamamos triple selección, ya que se hizo crecer las muestras iniciales de mosto en tres medios vínicos con concentraciones crecientes de etanol. Finalmente, la selección-4 se llevó a cabo con campana de Durham, ya que se midió la capacidad fermentativa de los cultivos puros provenientes de la selección-3. Entonces, las selecciones 1, 2 y 3 se basaron en el crecimiento de las levaduras, en cambio la selección-4 fue un screening por capacidad fermentativa. Después de cada una de estas selecciones se aisló un cierto número de cultivos puros de levadura que fueron analizados fenotípica y genéticamente.

Las cepas aisladas en las selecciones 1, 2, 3 mostraron un crecimiento y una capacidad fermentativa inferiores a las de la cepa comercial IOC, usada como referencia. De hecho, se realizaron tirajes en la empresa con algunas cepas aisladas a partir de estas tres selecciones, y los resultados fueron negativos, ya que estas cepas dejaban azúcares reductores residuales en estos tirajes.

La selección-4 se realizó aislando un cierto número de cultivos puros provenientes de la selección-3 y se les sometió a un screening por capacidad fermentativa con campana de Durham. La campana de Durham recoge el CO₂ producido durante la fermentación, de manera que indica la velocidad de fermentación de forma relativa. De los 149 cultivos puros incluidos en este screening (tabla 2), un 37% mostró una capacidad fermentativa mala y un 24% regular. El 39% restante mostró una capacidad fermentativa «Buena» o «Muy buena», valores equivalentes a los obtenidos por la cepa comercial IOC. Los clones que mostraron una capacidad fermentativa más elevada fueron identificados a través de su patrón de mtDNA.

El análisis del patrón de mtDNA de los 61 clones con capacidad fermentativa más elevada (tabla 3) demostró que un 50% de estos clones correspondía a la cepa comercial IOC. Recordemos que las muestras iniciales extraídas del mosto contienen una pequeña proporción de esta cepa que se habían amplificado durante la selección. El 50% restante de clones podríamos decir que mostraron patrones de mtDNA autóctonos, de los cuales un 33% correspondieron al patrón de mtDNA llamado CF3 y un 10% al patrón llamado CF2. Estos dos patrones, CF3 y CF2, resultaron ser muy parecidos entre ellos, y además, se encontraban en una proporción bajísima en las muestras iniciales de mosto, sugiriendo que las cepas de cava constituían una subpoblación muy pequeña y especializada dentro de las cepas del mosto.

Las 29 cepas con patrones de mtDNA autóctonos fueron escogidas para hacer tirajes semiindustriales en la empresa, ya que mostraban una capacidad fermentativa equivalente a la cepa comercial IOC y, por tanto, podían ser cepas válidas para llevar a cabo con éxito la segunda fermentación del cava.

Para hacer tirajes semiindustriales se realizaron en primer lugar lo que se llama pies de cubo. Un pie de cubo es un cultivo previo de las levaduras para adaptarlos a las concentraciones de etanol del vino. Lo que se llama propiamente tiraje es la operación de mezclar el vino base con unos 20 g/L, de sacarosa y una parte de las levaduras preadaptadas en el pie de cubo (alrededor de un 3%). Esta mezcla se homogeneiza y se llenan las botellas típicas de cava que después se taparán herméticamente. A partir de aquí comienza la segunda fermentación dentro de la botella hermética, de manera que las levaduras consumirán el azúcar y a causa de esto aumentará el grado alcohólico y la presión de CO₂.

Se realizaron unos tirajes semiindustrial con vino de la cosecha de 1995 con varias de las cepas seleccionadas y con la cepa comercial IOC de referencia. El desarrollo de la segunda fermentación se realizó a través de presión, que aumenta a medida que avanza la fermentación hasta llegar a un nivel máximo de unos 6 bar. La cepa comercial IOC tuvo una cinética ligeramente más rápida que las cepas del Penedés, pero la presión máxima alcanzada fue para todas aproximadamente la misma. Se realizó un segundo tiraje con vino de la cosecha de 1996, pero en este caso se usaron como referencia varias cepas comerciales destinadas a la elaboración de vinos espumosos. Pudimos observar que todas estas cepas mostraron una cinética de fermentación prácticamente idéntica y llegaron a una presión máxima similar de unos 6 bar.

Tras un análisis químico y organoléptico completo de los cavas obtenidos en estos tirajes, llegamos a la conclusión que las cepas seleccionadas eran válidas para llevar a término la segunda fermentación del cava usando los vinos y siguiendo los procedimientos habituales de la empresa.

Hasta ahora hemos visto que los grupos de cepas aislados en cada selección mostraban diferentes fenotipos, en cuanto a crecimiento y también a capacidad fermentativa. Ahora queremos comparar las distribuciones de patrones de mtDNA obtenidos en las cepas de cada selección, es decir, los patrones de mtDNA de las cepas iniciales de mosto o selección-1, los patrones de las cepas aisladas en la selección-2, en la selección-3 y en la selección-4 (tabla 4). El hecho más remarcable de estos resultados, es que estas cuatro distribuciones fueron completamente diferentes entre ellas. Por una parte, observamos que hubo seis patrones aparecidos en las selecciones 2, 3 y 4 que no aparecieron en las muestras iniciales de mosto (selección-1) y que, por tanto, eran minoritarias. Así, estas cepas se amplificaron durante las selecciones. Por otra parte, los patrones presentes en las cuatro selecciones, los patrones A y TE4, mostraron proporciones muy diferentes. Muchos de los patrones presentes en las muestras iniciales no aparecieron en ninguna otra selección. Todo ello parece indicar que las selecciones realizadas seleccionaron no sólo determinados fenotipos, sino también determinados patrones de mtDNA. Por tanto, parecería que existe una cierta correlación entre el patrón de mtDNA y el fenotipo.

Para reforzar esta idea, analizamos dos fenotipos completamente independientes por los cuales no habríamos seleccionado directamente: la utilización de galactosa y la capacidad de floculación. Observamos que todos los clones con los patrones A, B y TE4 y ninguno de los clones con el patrón CF3 crecieron en galactosa. Por tanto, había una correlación entre el patrón de mtDNA y la utilización de galactosa. Por contra, sólo los clones con el patrón D mostraron floculación, y hasta el momento sólo hemos detectado la capacidad de floculación en las cepas con este patrón. Hay una fuerte correlación entre el patrón D de mtDNA y el carácter floculante. Todo esto refuerza nuestra idea de que el patrón de mtDNA está fuertemente correlacionado con el fenotipo de las cepas de levadura.

Los cariotipos de las cepas de cava mostraron una gran similitud, con similar número de bandas y similar posición en el gel. A pesar de esto, las cepas con diferente patrón de mtDNA mostraron también cariotipos diferentes, e incluso detectamos una cierta heterogeneidad entre cariotipos de cepas con el mismo patrón de mtDNA. Por tanto, parece que el cariotipo es un buen indicador del grado de proximidad genética entre dos cepas.

La última parte de este trabajo consistió en una caracterización genética más detallada de las cepas seleccionadas para cava. Esta caracterización incluyó diferentes aspectos con la medida del contenido relativo de DNA total por citometría de flujo, la determinación del grado de esporulación de estas cepas, la viabilidad de sus esporas y el estudio de los cultivos monospóricos derivados, el estudio de la estabilidad genética de las cepas de cava a lo largo del crecimiento vegetativo y, finalmente, el estudio de la presencia de ciertas secuencias repetitivas de DNA de levadura.

La determinación del contenido relativo de DNA total medido por citometria de flujo permitió concluir que las cepas de cava tienen contenidos de DNA próximos al de una cepa diploide. A pesar de ello, creemos que podríamos mostrar varios grados de aneuploidia, teniendo también en cuenta que estas cepas esporulan en frecuencias bajas (<20%) y que sus esporas muestran viabilidades bajas (<50%). A partir del estudio de derivados monospóricos podemos concluir que el grado de polimorfismo cromosómico de estas cepas es elevado.

El estudio de la estabilidad genética de las cepas de cava durante el crecimiento vegetativo mostró un comportamiento diferente del patrón de mtDNA respecto al cariotipo dentro de nuestros límites de detección. El patrón de mtDNA se mantuvo totalmente estable en los experimentos realizados; en cambio el cariotipo mostró diferentes grados de inestabilidad dependientes de la cepa y del medio de cultivo. Estos datos explicarían porqué el cariotipo muestra más variabilidad que el patrón de mtDNA en las cepas naturales estudiadas. Este fenómeno tiene dos aspectos: en primer lugar, la inestabilidad es un hecho indeseable para una cepa de uso industrial, ya que representa una fuente de variación que podría modificar el comportamiento biotecnológico de la cepa. Por otro lado, los reordenamientos del cariotipo podrían ser un potencial de cambios genéticos para adaptar una cepa a unos requerimientos específicos. Igualmente, a partir de estos datos no podemos determinar si los cambios en el cariotipo se traducen en cambios en el fenotipo de estas cepas, ni tampoco si estos cambios tienen un sentido adaptativo.

El análisis de secuencias repetitivas de DNA de estas cepas muestra una gran presencia y ubicuidad de elementos transferibles T y 2 y una presencia mínima de elementos T y 1. La movilización o recombinación de estos elementos no explican la totalidad de la inestabilidad genética detectada.

A partir de mosto del Penedés se ha seleccionado una cepa del género Saccharomyces llamada NC5. Esta cepa es capaz de llevar a cabo la segunda fermentación a partir de vinos con características organolépticas especialmente restrictivas para las levaduras y dar cavas con características organolétpicas óptimas. El comportamiento de esta cepa es comparable, en todos los parámetros analizados, al de las cepas comerciales destinadas a la elaboración de vinos espumosos.

A la empresa CAVES NADAL por qué sin su apoyo este proyecto no habría sido posible.

Nadal D, Colomer B, Piña B, «Molecular polymorphism distribution in phenotypically distinct populations of wine yeast strains», Appl Environ Microbiol 1996; 62 (6): 1994-1950.

Nadal D, Carro D, Fdez.-Larrea L, Piña B: «Analysis and dynamics of the chromosomal complements of wild sparkling-wine yeast strains», Appl Environ Microbiol 1999; 65 (4): 1688-1695.

Tabla 1. Distribución de los patrones mtDNA más representados (³ 3 clones) de los 306 clones de mosto agrupados por cosechas