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Oenococcus
oeni (sin. Leuconostoc oenos) es una bacteria grampositiva perteneciente al grupo de las bacterias
lácticas, que posee un cromosoma con un tamaño de 1932 kb para la cepa GM,
según se ha deducido del análisis de fragmentos de macrorrestricción con
diversos enzimas. La cepa
PSU-1, aislada originalmente en la Penn State
University y usada comercialmente para iniciar la fermentación maloláctica,
posee un tamaño de 1857 kb –según macrorrestricción–, o de 1820 kb –según la
secuencia completa
de esta cepa–. Ambas cepas representan dos grupos genómicos divergentes de
acuerdo con los análisis de macrorrestricción (construcción de mapas que
indican el orden entre los lugares en que enzimas de restricción cortan los
cromosomas) y
ribotipificación (método de biología molecular que se emplea con fines
taxonómicos para obtener patrones genotípicos de las cepas, basándose en el
análisis de su RNA ribosómico, altamente conservado durante la evolución). El
contenido medio en GC (la evolución en el contenido en guanina + citosina es un
indicador de la evolución de las proteínas y, por tanto, un parámetro
filogenético) de la cepa PSU-1 es del 37,5 %.
En la actualidad se está
abordando la secuenciación del genoma completo de O. oeni, proyecto en el que participan varios laboratorios de
investigación franceses y americanos. Por el momento, se han obtenido datos
completos de la cepa de O. oeni
PSU-1, aunque aún se encuentran en formato de borrador. Disponer de tal
información es importante, pero ahora hay que procesar todos esos datos y
correlacionarlos, tanto con actividades metabólicas como con propiedades
tecnológicas. Además, la secuencia del genoma de una cepa no va a proporcionar
las respuestas a todas las preguntas que nos podemos plantear para todas las
cepas y condiciones posibles.
En cuanto a la identificación y caracterización de
genes concretos, se han publicado las secuencias de varios genes de O.
oeni, entre los que se encuentran los genes ribosómicos de las subunidades
16S y 23S, los genes del enzima maloláctico (mleA) y del transporte de ácido málico
(mleP), los genes de la acetolactato sintetasa (alsS) y de la acetolactato descarboxilasa
(alsD), genes de la ruta de utilización de la arginina, como la
arginina desiminasa (arcA), ornitina
transcarbamilasa (arcB) y carbamato
quinasa (arcC), los genes de la
histidina descarboxilasa (hdcA), los
de varias proteínas de estrés como hps18,
clpX, tras, genes que codifican para RNA de transferencia, como el gen
del Ala-t-RNA, del Leu-t-RNA, genes que codifican para la síntesis del Leu-t-RNA,
del operón de una permeasa de un oligopéptido y de un gen de
la biosíntesis de un polisacárido y de la subunidad b’ de la DNA polimerasa
(rpoC). Asimismo, se ha publicado la existencia de una secuencia de
inserción IS1165, de genes
relacionados con lugares de integración de fagos lisogénicos
en el cromosoma
bacteriano attB y de diversos
fragmentos aleatorios obtenidos por PCR. Varios de estos genes se han
localizado en los mapas genéticos de las cepas GM y PSU‑1.
Dificultad de manipulación genética
Con todo, no son demasiados los genes que están perfectamente
identificados en esta especie, y dada su importancia biológica e industrial
deberían existir más genes caracterizados, especialmente los relacionados con
propiedades tecnológicas.
Debido a la dificultad de
manipulación genética que presenta este organismo, hay pocos estudios que
empleen este tipo de técnicas en O. oeni.
Aunque se han encontrado algunos plásmidos en esta especie, en general no son
frecuentes y la mayoría de ellos son crípticos.
Por tanto, no parece que tengan implicaciones de importancia en propiedades
tecnológicas de las cepas que los portan. También presentan escasas relaciones
entre ellos, a excepción de unos pocos que, en realidad, podrían considerarse
casi el mismo plásmido aislado varias veces por distintos autores. Su contenido
en GC es cercano al de la bacteria, presentando mecanismos de replicación tipo
círculo rodante unos de ellos, y bidireccional otros. Son plásmidos de
características bastante particulares, incluso difíciles de clonar y estudiar
en plásmidos convencionales de E. coli.
Con todo, no se ha avanzado tampoco mucho en el conocimiento, y menos en la
aplicación de estos plásmidos, o derivados de los mismos, a la genética de
O. oeni. La existencia de plásmidos
propios en esta especie debería permitir abordar, en principio, la construcción
de vectores de clonación que se repliquen y se expresen en
O. oeni, aunque hasta el momento no existen noticias de que esto se
haya conseguido.
Algo parecido ocurre con los bacteriófagos (virus bacterianos) que
atacan esta especie. Se han estudiado y caracterizado algunos fagos específicos
de O. oeni, aunque no se han llegado
a desarrollar todavía sistemas de manipulación genética basados en ellos;
existen, sin embargo, algunos grupos que han trabajado o están trabajando para
lograrlo. Es importante indicar que estos bacteriófagos presentan muchas
características comunes entre sí, tanto morfológicas como genéticas o
funcionales. Aunque un porcentaje importante de cepas de Oenococcus oeni
son portadoras de fagos lisogénicos (un 70 %), y se
han detectado fagos libres en vinos (20 % de los vinos), parece que los fagos
de O. oeni ocasionan sólo
excepcionalmente la lisis de las bacterias en vino. Por tanto, la mayoría de
evoluciones irregulares de la fermentación maloláctica serían atribuibles a
otras causas. De todas formas, ha sido posible obtener cepas de
O. oeni resistentes a fagos, que
mantienen tanto esa resistencia como características tecnológicas adecuadas
durante muchas generaciones.
Plásmidos y transposones
Como hemos apuntado anteriormente, Oenococcus
oeni presenta grandes dificultades de manipulación genética. Uno de los
obstáculos más importantes para la consecución de este objetivo es que, hasta
el momento, no se ha conseguido llevar a cabo la transformación genética de
O. oeni. Los intentos han sido numerosos
(y los grupos de investigación que se lo han propuesto también), pero hasta la
fecha no se ha logrado en esta especie. Una vez más parece ser un organismo con
un comportamiento genético muy particular, como se manifiesta al poseer
plásmidos propios y fagos difíciles de manipular.
No obstante, nuestro grupo de investigación ha logrado introducir
plásmidos conjugativos en esta bacteria: el plásmido pVA797 ha sido transferido
desde Streptococcus sanguis a
O. oeni a través de Lactococcus lactis. Las eficiencias de este proceso son muy bajas,
y se han obtenido transconjugantes en los que el plásmido original ha sufrido
varias deleciones y reorganizaciones, dando lugar a otro plásmido más pequeño
denominado pLO1. Una mayor eficiencia de transconjugantes se consiguió al
transferir el plásmido pIP501 desde S.
sanguis a O. oeni vía L. lactis. Al igual que en el caso
anterior, el plásmido que presentaban los transconjugantes era de menor tamaño,
habiendo sufrido deleciones extensas en todos los casos, que afectaban a las
regiones de transferencia conjugativa y la estabilidad de los plásmidos
originales. Como dato curioso del comportamiento de estos plásmidos
reorganizados y delecionados inestables en O.
oeni, hemos visto que al ser transferidos a L. lactis presentan una
estabilidad completa en esta bacteria
láctica. En otras palabras, ha sido posible introducir plásmidos conjugativos
en O. oeni, pero con una baja
eficiencia y dando como producto unos plásmidos menores y bastante inestables.
En esta ocasión, volvemos a encontrarnos con particularidades de
O. oeni que dificultan una manipulación
genética sencilla y eficaz.
Nuestro grupo de investigación también ha logrado introducir por
conjugación en O. oeni los
transposones Tn916 y Tn925. Estos transposones se integran en
distintos sitios del cromosoma de O. oeni
y no sufren aparentemente transposiciones secundarias. En este caso, la
estabilidad es elevada. Todo ello, junto con el conocimiento que vamos
poseyendo de éstos y otros transposones, posibilitaría el desarrollo de
vehículos de manipulación genética basados en los mismos. Por el momento,
seguimos a la espera, y estos dos métodos conjugativos, mediante plásmidos y
transposones, son los únicos sistemas disponibles de introducción de DNA
exógeno en Oenococcus oeni descritos
hasta la fecha.
Mutación maloláctica
En cuanto a la obtención de cepas mutantes mediante sistemas que no
impliquen DNA recombinante, hemos podido aislar en nuestro equipo mutantes
malolácticos que carecen por completo de esta actividad. Por un lado, estos
mutantes permiten estudios fisiológicos de interés básico y tecnológico, y por
otro permiten la utilización de sistemas aprobados para manipulación de
organismos de interés alimentario como O. oeni. En contrapartida, también hemos
desarrollado sistemas no recombinantes que nos permiten aislar cepas de
O. oeni con capacidad de fermentación
maloláctica aumentada.
Las
levaduras crecen con mucha facilidad en el mosto en fermentación, mientras que
las bacterias lo hacen con mucha dificultad y mucho más lentamente. Es por ello
que la posibilidad de tener una levadura capaz de hacer la fermentación
maloláctica siempre ha llamado la atención. Una vez desarrolladas las
herramientas adecuadas para levaduras, los primeros intentos de construir una
levadura maloláctica mediante técnicas de ingeniería genética fueron en 1984,
al clonar el gen maloláctico de L.
delbrueckii en Saccharomyces
cerevisiae. La actividad detectada en la cepa transformada fue muy baja, ya
que tan sólo un 1 % de L-malato se transformaba en L-lactato. Posteriormente se
construyó una genoteca de O. oeni en
una cepa de E. coli incapaz de usar
L-malato. Los clones recombinantes fueron inestables y no se llegó a averiguar
si eran capaces o no de llevar a cabo la fermentación maloláctica. En 1993 y
1994 se logró clonar el gen maloláctico de Lactococcus
lactis en E. coli y en S. cerevisiae. En ambos casos se
demostró que las cepas de E. coli y
de S. cerevisiae transformaban ácido
L-málico en ácido L-láctico, pero con una muy baja eficacia. Posteriormente, en
1997, se construyó una levadura maloláctica recombinante que coexpresaba el gen
de la malato permeasa de Schizosaccaromyces
pombe y el gen maloláctico de Lactococcus
lactis. A diferencia de las levaduras malolácticas previamente
desarrolladas, ésta era capaz de completar la fermentación maloláctica en menos
de siete días en mostos de la variedad chardonnay. En este caso, la clonación
de la malato permeasa permitió que el transporte del ácido málico al interior
de la levadura dejase de ser el paso limitante en el proceso de degradación del
ácido málico en la levadura maloláctica. Con todo, el haber logrado que una
levadura realice la fermentación maloláctica no supone la eliminación de las
bacterias lácticas para realizar este proceso en bodega. Además del hecho que
las bacterias lácticas proporcionan otros metabolitos de importancia
organoléptica, aparte de la conversión del ácido málico a ácido láctico,
también le confieren una mayor estabilidad microbiológica a los vinos en los
que se desarrollan. Por otro lado, si una levadura efectúa la fermentación
maloláctica al mismo tiempo que la alcohólica, ambos procesos no pueden
desacoplarse, ni interrumpirse de forma independiente, y ello significa que o
bien el ácido málico se degrada siempre completamente, o se interrumpe la fermentación
alcohólica.
Sistemas de tipificación
Finalmente, en cuanto a los
sistemas moleculares que se han empleado en la especie Oenococcus oeni,
merece la pena indicar el desarrollo de sistemas
de identificación o de tipificación para esta especie, y un buen ejemplo lo
tenemos en un artículo de A. Bordons et al. en este mismo número de la
revista. Muchas técnicas se han desarrollado para ello, entre las que indicamos
los RAPD (amplificación aleatoria de DNA polimórfico), RFLP-PFGE (polimorfismo
en la longitud de los fragmentos de amplificación analizado por electroforesis
en campo pulsante), 16S-ARDRA (análisis de restricción del DNA ribosómico 16S
amplificado), FISH (hibridación in situ
con fluorescencia), etc. La mayoría de ellas parecen indicar que la diversidad
intraespecífica de O. oeni es baja,
aunque hay indicios que podrían sugerir la existencia de dos subespecies.
También se ha intentado relacionar datos de técnicas moleculares con
propiedades tecnológicas u orígenes geográficos de las cepas aisladas. Por el
momento, la información que han obtenido distintos grupos de investigación es
no sólo parcial, sino incluso contradictoria, por lo que es necesario
profundizar más y con herramientas mejores y más potentes que las empleadas
hasta el momento.
En conclusión, queda por
conocer lo más interesante en la genética de Oenococcus oeni. Pensemos que nos hallamos al inicio del camino, y
hasta el momento no se han descrito apenas manipulaciones genéticas en esta
especie. Cuando podamos realmente controlar la genética de este organismo,
podremos plantear conocer mejor fisiológicamente esta bacteria e incidir en sus
propiedades tecnológicas. Ello, sin duda, nos permitirá trabajar con cepas
mejores, más resistentes, más seguras, más rápidas, y con propiedades mejoradas
respecto a las actuales.
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GLOSARIO
bacteriófago:
partícula de tipo vírico que infecta y lisa –destruye– bacterias, extendiéndose
mediante la liberación de nuevas partículas víricas maduras de las células
lisadas.
deleción: supresión de una porción de un gen.
lisogénico:
uno de los dos tipos de ciclo de vida de un bacteriófago (lítico y lisogénico)
por el que no produce partículas fágicas, llegando normalmente el DNA del fago
a formar parte del cromosoma bacteriano en forma de profago.
macrorrestricción: construcción de mapas que indican el orden entre
los lugares en que enzimas de restricción cortan los cromosomas.
plásmido
conjugativo: plásmido que transfiere genes de una célula procariótica a
otra por un mecanismo de contacto entre ellas.
plásmido: elemento genético extracromosómico
bacteriano, que no es esencial para el crecimiento de la célula y que no tiene
forma extracelular.
ribotipificación: método de biología molecular que se emplea con fines taxonómicos para
obtener patrones genotípicos de las cepas, basándose en el análisis de su RNA
ribosómico, altamente conservado durante la evolución.
transformación: transferencia de información genética por medio de DNA libre.
transposón: elemento genético que puede
desplazarse de un lugar a otro en un cromosoma y que, además de transportar
genes de la transposición, lleva algunos otros; a menudo, son genes que
producen fenotipos que pueden ser seleccionados, por ejemplo, resistencia a
antibióticos.
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[29.09.03]
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