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Brettanomyces/Dekkera: control y detección en bodegas

Eva Navascués López-Cordón
Área Biotecnología Agrovin
enavascues@agrovin.com

La percepción olfativa de estos fenoles volátiles resulta controvertida ya que los descriptores sensoriales tipo animal se han considerado tradicionalmente como característicos de determinados vinos de crianza en madera. Dado que en pequeñas concentraciones, estos compuestos contribuyen a la complejidad aromática del vino, y en concentraciones grandes enmascaran completamente su perfil sensorial con sensaciones muy desagradables, para la descripción de fenoles volátiles se prefiere hablar de «umbral de preferencia» en lugar de «umbral de detección». Se define como umbral de preferencia la concentración de fenoles volátiles a partir de la cual el 50% de los catadores considera una muestra como defectuosa. Los umbrales determinados para el 4-etilfenol son muy bajos, del orden de 440 µg/L, para 4-etilfenol, y de 620 µg/L para la suma de 4-etilfenol y 4-etilguayacol.1

En la determinación sensorial de los vinos afectados por Brett, desempeña un importante papel la matriz intrínseca del vino. Así en los vinos con más cuerpo y estructura se detecta el carácter fenólico a mayores concentraciones de 4-etilfenol que en los vinos de menos consistencia. En este aspecto, también la variedad de uva parece influir, siendo las variedades más robustas (cabernet-sauvignon), más proclives a enmascarar un contenido elevado en 4-etilfenol.

Esta doble cara de la presencia de etilfenoles en vino ha contribuido a despistar a bodegas y enólogos sobre la naturaleza, procedencia y repercusiones del problema. Vinos en perfectas condiciones organolépticas han manifestado después de algunos meses en la botella alteraciones graves, de difícil solución. Es por ello que el conocimiento de la fisiología y de las características de desarrollo del principal microorganismo causante, Brettanomyces/Dekkera, puede ayudar a su detección y control, y así evitar sorpresas desagradables en un futuro.

Brettanomyces/Dekkera y síntesis de fenoles volátiles

Las levaduras del género Brettanomyces, o su forma teleomórfica (nombre que reciben las especies que presentan reproducción sexual y en consecuencia, formación de esporas por meiosis) Dekkera, fueron descritas por primera vez por Claussen en 1903, en la producción de cerveza.2 Este género se conoce desde hace tiempo como agente contaminante, en la industria cervecera, de la sidra y de bebidas carbonatadas.3 En la industria enológica su descripción como alterante es más reciente. Aunque el género lo constituyen cinco especies diferentes, en vinos aparece únicamente Dekkera bruxelliensis.

El origen de los fenoles volátiles está relacionado con la actividad secuencial de dos enzimas que descarboxilan los ácidos hidroxicinámicos (por ejemplo: ácido ferúlico, ácido p-cumárico y ácido cafeico) en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles),4 como puede observarse en la figura 1.

Figura 1. Síntesis de etilfenoles por Brettanomyces/Dekkera ssp. a) Descarboxilación de los ácidos hidroxicinámicos; b) reducción de vinilfenoles

El primer paso de descarboxilación está presente en un gran número de bacterias, hongos y especies de levaduras.5-8 Sin embargo, el segundo paso, o la reducción de los vinilfenoles se ha registrado de manera especialmente efectiva en varias especies de levaduras: Dekkera bruxelliensis, D. anomala, Pichia guillermondi, Candida versarilis, C. halophila y C. mannitofaciens.9

Herestzyn describió por primera vez la producción de etilfenoles por Brettanomyces/Dekkera,10 pero la contribución de estas moléculas al carácter fenólico en los vinos y su relación con la actividad de levaduras del género Brettanomyces ha sido esclarecida recientemente.11

Anteriormente su origen se relacionó con la actividad bacteriana.12 De hecho, las bacterias lácticas pueden producir cantidades significativas de vinilfenoles, pero producen únicamente trazas de etilfenoles en las condiciones del vino.1,11 Las levaduras fermentativas Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras consideradas alterantes del vino (Pichia, Torulaspora, Zygosaccharomyces) pueden producir vinilfenoles pero son incapaces de producir etilfenoles.13 En D. bruxelliensis las enzimas cinamato descarboxilasa y vinifenol reductasa son muy activas en las condiciones del vino y se la considera el principal causante de este problema.

Brettanomyces, al contrario de las levaduras responsables de la fermentación del mosto, se caracteriza por una actividad fermentativa baja y crecimiento lento. En condiciones de cultivo sobre medio sólido forma colonias al cabo de siete a diez días. Crece en medios de cultivo habituales de crecimiento de levaduras (MEA, YPD), sin embargo, cuando se desea aislarlo de mosto o vino es necesario emplear medios de cultivo diferenciales que impidan el crecimiento de otros microorganismos, mucho más activos que Brettanomyces y que ocultan o impiden el desarrollo de las colonias de Brett.

La morfología celular de Brettanomyces es ojival o cilíndrica, con gemación multipolar en reproducción vegetativa. Una de las características de este género es su tamaño celular variable y la formación de filamentos. En vinos se observan siempre células mucho más pequeñas que en medio de cultivo y son frecuentes estas formas filamentosas que ayudan a la adherencia del microorganismo a las superficies, por ejemplo de las barricas (fig. 2).


Figura 2. Microfotografía de cultivo de Brettanomyces/Dekkera. a) Variabilidad morfológica y de tamaño celular; b) forma filamentosa

Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia fisiología del microorganismo. En efecto, la biosíntesis de fenoles volátiles se realiza a partir de ácidos hidroxicinámicos y en vinos tintos el contenido de estos compuestos es mayor. Además, al ser una levadura de crecimiento muy lento, la alteración se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre todo, la crianza del vino, habitual en los vinos tintos de gama alta. En las barricas de madera el microorganismo tiene a su disposición todo el sustrato y tiempo suficiente para realizar su actividad. La naturaleza porosa de la madera y su difícil limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso después del lavado de la barrica. Además, D. bruxelliensis tiene la capacidad de degradar uno de sus componentes, la celobiosa.14

Junto con la formación de fenoles volátiles, Brettanomyces produce elevadas cantidades de ácido acético y tiene la capacidad de sintetizar, en condiciones especiales, tetrahidropiridinas que se identifican con el «gusto a ratón».10,15,16 También se le atribuye la producción de isovalérico y otros ácidos grasos que confieren gustos a rancio y de ciertas esterasas, acentuando la pérdida de aromas afrutados del vino. Por todo ello, el género Brettanomyces/Dekkera es uno de los más temidos agentes microbianos de los vinos.

Procedencia de las poblaciones de Brettanomyces

Brettanomyces es un microorganismo ubicuo, con poblaciones escasas pero repartidas en suelo, cortezas de árboles y sustratos azucarados (frutos, miel). Su detección en uvas y mostos es poco frecuente debido sobre todo a la gran competencia existente con otros microorganismos mucho más activos. No obstante, se han detectado focos en viñedos particulares. Su aislamiento es frecuente en materiales de bodega, mangueras, depósitos, suelos, siempre asociado a una higiene deficiente. Pero donde es más habitual su presencia es en las barricas y tinas de madera.

El desarrollo de las poblaciones de Brettanomyces se inicia después de la fermentación alcohólica (fig. 3). En este momento, y a partir del reducido número de células procedentes del viñedo que durante la fermentación alcohólica no han tenido la oportunidad de multiplicarse debido a su escasa competitividad respecto a S. cerevisiae, inician su desarrollo en un vino poco o nada protegido (ausencia de sulfuroso). Dependiendo del arranque más tardío de la fermentación maloláctica, la población será mayor, y aunque luego se corrija con sulfuroso, mayor la probabilidad de presentar células viables capaces de desarrollar la alteración posteriormente.


Figura 3. Dinámica de las poblaciones de levaduras fermentativas, bacterias lácticas y Brettanomyces desde la llegada a la uva hasta el vino elaborado

Durante la crianza, procedentes del vino o de las propias barricas ya contaminadas, las poblaciones aumentan de manera lenta pero sin competencia. Aquí se originan los principales riesgos. Es destacable señalar que no hace falta un gran número de células para desarrollar la alteración, y que por encima de 1000 células/mL la calidad organoléptica del vino está seriamente comprometida.17

Condiciones de desarrollo de Brettanomyces en bodega

A continuación se analizan los distintos factores que contribuyen al desarrollo de las poblaciones de Brettanomyces en la bodega y que se traducen por tanto en un mayor riesgo de producción de fenoles volátiles.

a) Nutrientes.Como fuente de carbono Brettanomyces emplea azúcares residuales presentes en el vino después de fermentación alcohólica. Al no tener un metabolismo muy activo, 300 mg/L de azúcares son más que suficientes para el desarrollo de una población alterante. Una de las causas de que las contaminaciones por Brett sean más frecuentes en los vinos de elevada graduación alcohólica, a pesar del carácter antimicrobiano del etanol, es que estos vinos, procedentes de uvas muy maduras, presentan mayor cantidad de azúcares residuales (apenas glucosa y fructosa, pero sí otras pentosas residuales).

El azúcar trehalosa, procedente de la autolisis de las levaduras, constituye una fuente de carbono importante en los vinos con crianza sobre lías. B. bruxelliensis desarrolla además complejas estrategias para su desarrollo en un medio tan empobrecido nutricionalmente como el vino: presenta una fuerte actividad glicosidasa, capaz de liberar la glucosa ligada a los antocianos. Mediante varias actividades celulolíticas, degradan la celobiosa de la madera de las barricas, que junto a la propia reducción de los vinilfenoles en etilfenoles supone un mecanismo de obtención de energía.

En cuanto a los compuestos nitrogenados, Brettanomyces presenta requerimientos escasos, aunque la presencia de aminoácidos y sales amoniacales estimula la proliferación celular. De aquí que se aconseje la nutrición adecuada en fermentación alcohólica, pero nunca en exceso, sobre todo de sales de amonio.

b) Tiempo. Ya se ha comentado que Brettanomyces posee un metabolismo lento, por lo que el factor tiempo es requisito fundamental para el desarrollo de poblaciones alterantes. Se explica de esta forma la mayor incidencia de etilfenoles en vinos de crianza. Los vinos conservados en barricas usadas presentan mayor incidencia de concentración de estos compuestos. Efectivamente, la reutilización de las barricas contribuye en gran medida a acentuar el problema, ya que buena parte de las células de Brettanomyces permanecen en la barrica después del trasiego del vino, resisten al proceso de limpieza, y el vino nuevo con el que se rellena la barrica supone una renovación del sustrato, sobre el que se desarrollará una población más importante.

c) Temperatura. Como para todos los microorganismos, la temperatura activa el metabolismo celular. Para el control de Brett, la crianza del vino precisa una atención máxima de primavera a otoño, donde la temperatura y el ritmo de evaporación aumentan. Por otro lado, Brettanomyces presenta actividad a bajas temperaturas y tan sólo por debajo de 8 ºC se inhibe su crecimiento.

d) Presencia/ausencia de oxígeno. Se trata de una levadura capaz de desarrollarse en anaerobiosis estricta, aunque la presencia de oxígeno favorece su desarrollo y estimula la síntesis de acidez volátil.

¿Y las nuevas prácticas?

Las nuevas prácticas enológicas dirigidas hacia la elaboración de vinos de calidad pueden constituir factores de riesgo y su aplicación debe conllevar la adopción de medidas de control para evitar el desarrollo de Brettanomyces. Así:

- Los vinos procedentes de uvas en el punto correcto de maduración fenólica, que en nuestras latitudes se acompaña de elevado grado alcohólico y por tanto de mayor proporción de azúcares residuales, suponen un aumento del sustrato disponible para Brett.
- Las maceraciones prefermentativas en frío, proporcionan tiempo y sustrato para el desarrollo de las poblaciones procedentes de la uva.
- La crianza sobre lías enriquece el medio en factores nutritivos (trehalosa y sustancias nitrogenadas).
- El empleo, cada vez más habitual, de la microoxigenación favorece el desarrollo del microorganismo, tanto de manera directa, al implicar una mayor presencia de oxigeno, como indirecta, al favorecer la combinación del sulfuroso libre o al implicar un retraso en el inicio de la fermentación maloláctica.18
- La crianza en madera, además de sustrato, supone la permanencia del vino en su contacto, cediendo el tiempo imprescindible para su desarrollo.
- La tendencia hacia la reducción de las dosis de sulfuroso en la elaboración, es uno de los factores que más a contribuido a la extensión del problema. Precisamente, el sulfuroso es un instrumento eficaz y permitido para el control de Brettanomyces.
- Por último, la salida al mercado de vinos sin clarificar, sin estabilizar y por supuesto sin filtrar, hace posible la presencia del microorganismo al final del proceso y la formación de etilfenoles en la propia botella.

Control preventivo de Brettanomyces

El control del desarrollo de Brettanomyces en la bodega se realiza a tres niveles:

1. Materia prima. Prestando atención a la sanidad de la uva. Aunque las poblaciones de Brett son de partida escasas, se ha de tener en cuenta que en uvas en deficiente estado sanitario, la población de levaduras pasa de 100 células/g, a 100 millones de células/g, y la proporción de Brettanomyces puede ser considerable.
La aplicación de maceraciones prefermentativas, donde la competencia de S. cerevisiae está inhibida por la temperatura, supone una práctica de riesgo, ya que levaduras contaminantes como Brett proliferan a temperaturas bajas (> 8 ºC).

2. En el vino, el sulfuroso es el instrumento más eficaz para el control del desarrollo de Brettanomyces. Contrariamente a lo que se cree, Brett es bastante sensible a su presencia, y la existencia de fenómenos de resistencia entre cepas es escasa. Se debe tener en cuenta la relación del sulfuroso libre con el pH. Al ser el SO2 molecular la forma activa, a pH altos el control debe ser más riguroso.

3. En las barricas, verdadero punto crítico de contaminación, se debe prestar especial atención a su limpieza y desinfección, asumiendo que es imposible su esterilización total:

- Debe realizarse inmediatamente después de cada trasiego y antes de ser rellenadas. La temperatura de lavado se debe mantener, a menor temperatura, mayor tiempo de aplicación. Nunca por debajo de 60 ºC. El vapor es más eficaz pero repercute en la calidad de las barricas y se aconseja reservarlo para casos de sospecha de contaminación.
- La limpieza a alta presión (80-110 bares) elimina los depósitos fijos, siempre que se empleen cabezas rotativas adaptadas a la geometría de la barrica y tiempos suficiente (10-20 minutos). No afecta a la integridad de la madera.
- El empleo de productos de limpieza, también es aconsejable reservarlo para barricas sospechosas.
- El azufrado permite secar la madera sin alteración microbiana durante cinco días aproximadamente. Se debe repetir la operación cuando la barrica está seca.

Detección de Brettanomyces en vinos

Para detectar su presencia, confirmar su ausencia o verificar la existencia de un problema de una manera efectiva en bodega pueden seguirse dos líneas analíticas, útiles en función del objetivo perseguido:

Análisis del contenido de 4-etilfenol/guayacol mediante cromatografía gaseosa. Permite el seguimiento de la evolución del contenido de etilfenoles en el tiempo en un vino determinado. Cuando el compuesto es detectado, implica que la población de Brettanomyces es muy elevada y reparar la alteración prácticamente imposible. Se trata de un método confirmativo. Es sin embargo útil, combinada con la detección del microorganismo, en los casos en los que se registran poblaciones importantes pero no la alteración sensorial e imprescindible en el caso de filtración amicróbica o aplicación de niveles de sulfuroso elevados, que eliminaran a la microbiota contaminante, pero no el resultado de su acción.


Figura 4. Desarrollo de población de Brettanomyces y génesis de 4-etilfenol y 4-etilguayacol. Inóculo inicial: 105 células/mL

Detección del microorganismo. La formación de 4-etilfenol/guayacol en vinos se encuentra retardada respecto a la proliferación de las poblaciones de Brettanomyces, como se observa en la figura 4. Por ello es posible detectar un posible problema, antes de que la alteración sensorial sea perceptible. La detección de Brett empleando los medios de cultivo habituales en microbiología del vino se ve impedido por otros microorganismos (levaduras, bacterias lácticas, etc.) mucho más competitivos que ellos en condiciones favorables. Obliga a la utilización de medios de cultivo con agentes selectivos y diferenciales y, en muchos casos, a la comprobación microscópica de las colonias. A diferencia de otras contaminaciones microbianas, las poblaciones de riesgo en vinos son del orden de 10 UFC /mL, por lo que se hace imprescindible tratar volúmenes grandes de vino. El medio DBDM ha demostrado su eficacia en la detección de levaduras productoras de fenoles volátiles.13 Hay que tener en cuenta que, debido al crecimiento lento del microorganismo, los resultados se obtienen a los 8-10 días de incubación. En casos de vinos con crianzas muy largas es frecuente la presencia de formas viables pero no cultivables,19 en poblaciones que han permanecido en contacto con el vino un tiempo largo (más de dos años), siendo habituales los falsos negativos. La utilización de técnicas de biología molecular, solventa este problema. Mediante el análisis de secuencias génica exclusivas de las células de Brettanomyces se detecta con exactitud su presencia en pocas horas. En estos casos la detección de poblaciones de Brettanomyces se realiza por nested PCR.20,21

Tratamiento de vinos contaminados

En el caso de que la detección de Brettanomyces sea positiva hay que considerar la adopción de medidas correctoras. Es recomendable analizar el contenido en fenoles volátiles y realizar una cata fuera de la bodega. Se ha comprobado que la percepción organoléptica de los fenoles volátiles en el vino disminuye cuando se realiza en el interior de la bodega de origen, debido a la presencia en el ambiente de las propias sustancias volátiles que producen un fenómeno de acomodación de la pituitaria.

Cuando el vino no manifiesta sensorialmente la alteración y el contenido de fenoles volátiles es inferior a 400 µg/L, el objetivo prioritario es detener el desarrollo de Brettanomyces y por tanto el aumento de la concentración de fenoles volátiles. Para ello se deben corregir los niveles de sulfuroso libre en cantidad suficiente y acorde con el pH, por encima de 0,8 ppm de SO2 molecular. Además es recomendable acotar perfectamente el lote alterado, evitando las mezclas y la utilización de las barricas que han tenido contacto con el vino contaminado. Con respecto a estas barricas, deben acometerse programas de limpieza y desinfección especialmente enérgicos y cuidadosos.

En el caso de que el vino contaminado sí manifieste la alteración, además de las medidas anteriores, se debe emplear algún tratamiento desodorante, capaz de eliminar el olor al menos parcialmente (bentonita, caseína, carbón, pvpp). En estos casos y cuando la contaminación es muy elevada (> 1000 células/mL) debe considerarse realizar procedimientos de clarificación y posterior filtración por debajo de 1 micrómetro. La pasteurización es también efectiva, pero poco aplicable a vinos de crianza. Además, las barricas que han albergado vino con grado de contaminación son un peligro potencial para la bodega y deben desecharse. Una barrica contaminada es foco de infección para las restantes.

Bibliografía
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17 González, U. y Navascués, E.: «Contaminación por Brettanomyces en vinos españoles: incidencia y causas más frecuentes», V Foro Mundial del Vino, Logroño, 2006.
18 Arvik, T. y Henick-Kling, T.: «Brettanomyces bruxelliensis occurrence, growth, and effect on wine flavor», Practical Winery 2002; May-June, 48-56.
19 Millet V. y Lonvaud-Funel, A.: «The viable but not culturable state of wine microorganisms during storage», Letters in Applied Microbiology 2000; 30 (2): 136-141.
20 Ibeas, J.I., Lozano, I. Perdigones, F. y Jiménez, J.: «Detection of Dekkera-Brettanomyces strains in Sherry by a Nested PCR Method», Applied and Environmental Microbiology 1996; 62 (3): 998-1003.
21 Navascués, E.: «Método de detección directa de Brettanomyces ssp. en vinos de crianza en barrica», Enólogos 2003; 23: 24-26.



[28.02.07]
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