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Aplicación de levaduras no-Saccharomyces en enología

Jordi Tronchoni, Pilar Morales y Ramon González
Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (CSIC-UR-CAR)
Finca La Grajera
Logroño, La Rioja

Las no-Saccharomyces en enología

En enología, el término no-Saccharomyces engloba a todas aquellas levaduras de diferentes géneros que están presentes en el mosto durante las primeras fases de la fermentación, antes de que Saccharomyces cerevisiae las desplace, siendo esta última especie la que se encuentra mayoritariamente al final de la fermentación. El término no-Saccharomyces ha pasado de emplearse casi exclusivamente para levaduras que se consideraban como alterantes de la calidad, a estar cada vez más ligado a un grupo de levaduras que pueden contribuir positivamente, al aportar variabilidad y tipicidad, y que constituyen una fuente de innovación enológica.

Disponibilidad de las levaduras no-Saccharomyces

A pesar de que en los últimos años estamos asistiendo a un mayor reconocimiento del papel de estas levaduras en la elaboración del vino, en realidad hace ya casi 15 años que están en el mercado (en 2003 apareció a la venta Torulaspora delbrueckii y Kluyveromyces thermotolerans (ahora Lachancea thermotolerans) en el catálogo de un productor comercial de levaduras.

Inicialmente se pusieron a la venta como cultivos iniciadores mixtos en los que se encontraban estas no-Saccharomyces junto a S. cerevisiae. Con el paso de los años, hemos visto cómo cada vez más empresas ofrecían nuevas especies de levaduras en sus catálogos. Hoy en día, no solo encontramos la posibilidad de adquirirlas a través de diferentes empresas y distribuidores tanto internacionales como nacionales (tabla 1), sino que además existen pequeñas compañías especializadas en la producción de levadura a demanda, que incluyen las no-Saccharomyces en su oferta; y centros de investigación especializados en microbiología del vino que también proporcionan este servicio.

Tabla 1. Algunas especies de levaduras comercializadas como LSA para uso enológico

Cepas comerciales

 

Atributos por los que se comercializan

Torulaspora delbrueckii

Mejorar aroma y complejidad en boca de tintos y blancos

Lachancea thermotolerans

Productora de ácido láctico, proporciona redondez y equilibrio ácido al vino

Torulaspora delbrueckii /Saccharomyces cerevisiae

Incrementa la complejidad vínica proporcionando aromas frutales

Metschnikowia pulcherrima

Mejora de aromas varietales, así como terpenos y tioles

Metschnikowia fructicola

Protección natural contra la contaminación por microorganismos, permite reducir el uso de sulfuroso

Pichia kluyveri

Mejora de aromas varietales, así como tioles

Schizosaccharomyces pombe

Permite la desacidificación maloláctica

 

Precisamente la elaboración y distribución de estas levaduras como levadura seca activa (LSA) es una de las limitaciones que existen en su producción, ya que diferentes géneros de levaduras requieren diferentes condiciones de producción. Además, el proceso de producción de LSA incluye fases en las que las levaduras son sometidas a un gran estrés, y si bien este proceso ha sido muy optimizado para S. cerevisiae, consiguiendo grandes rendimientos de supervivencia de la levadura tras la rehidratación, no lo está tanto para las no-Saccharomyces. Aun así y siempre que los rendimientos sean aceptables será mucho más práctico proporcionar la levadura en forma de LSA, al ser un formato más estable, duradero y económico, que la levadura fresca, menos estable a pesar de que se consigan mejores viabilidades.

Actualmente, para el uso de estas levaduras como cultivos iniciadores se sigue un procedimiento secuencial, de modo que tras la adición de la no-Saccharomyces se deja fermentar unos días (de dos a cuatro según las diferentes empresas) y se inocula S. cerevisiae, que será la encargada de terminar la fermentación, desplazando casi por completo a las levaduras anteriores. En la inoculación secuencial es necesario agregar nuevas fuentes de nitrógeno en la segunda inoculación para asegurar un correcto crecimiento de S. cerevisiae. Cuando no se realiza esta corrección se suelen observar problemas de imposición para S. cerevisiae, ocasionando paradas o ralentización de la fermentación.

 

Las levaduras no-Saccharomyces como herramienta de mejora en la fermentación y diversificación del producto

Tal como hemos dicho anteriormente, dentro del término no-Saccharomyces se incluye a un gran número de diferentes géneros y especies de levadura, cada cual con características metabólicas particulares, capaces de aportar su impronta al vino. Es precisamente esta diversidad la que ha permitido usar levaduras no-Saccharomyces como herramientas con las que mejorar la fermentación vínica, proporcionando la posibilidad de crear productos más complejos, que recuperen parte de la originalidad de las fermentaciones espontaneas (cuando éstas acaban bien) y que algunas echan en falta en los vinos fermentados con cepas iniciadoras de S. cerevisiae.

El uso de cultivos iniciadores, que combinen cepas de no-Saccharomyces con cepas de S. cerevisiae, o su uso en inoculación secuencial, se postula como una alternativa a la recuperación de la variabilidad que existe en los cultivos “naturales” durante fermentaciones espontaneas, pero sin los problemas que pueden aparecer en éstos, como pueden ser las paradas de fermentación o la aparición de defectos sensoriales. En la medida en la que se busca imitar en cierta forma una fermentación espontánea, se trata de una tendencia que el consumidor final del vino también puede encontrar atractiva, al combinar la innovación con el respeto a la tradición.

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Figura 1. Aspectos de la calidad del vino que pueden modularse
mediante el uso de levaduras no-Saccharomcyes

Las áreas en las que las levaduras no-Saccharomyces pueden ser interesantes por lo que aportan al vino son varias (fig. 1). Una de las principales es indudablemente el aroma, y también una de las primeras que se han estudiado. En el vino, se consideran aromas primarios aquellos que derivan de las uvas, mientras que los aromas secundarios derivan del metabolismo de las levaduras.

Varios de estos compuestos aromáticos de la uva están presentes en forma de precursores glucosilados que, al no ser volátiles, carecen de aroma, y que pueden ser hidrolizados por el enzima β-glucosidasa, normalmente en combinación con otras glucosidasas, para formar volátiles libres que contribuirán al aroma del vino.

El problema es que tan solo unas pocas cepas de S. cerevisiae poseen en su genoma genes que codifiquen estas funciones. En cambio, varios de los géneros de no-Saccharomyces sí los poseen. Los podemos encontrar, por ejemplo, en especies de los géneros Debaryomyces, Hansenula, Candida, Pichia o Kloeckera. En todas ellas, estas actividades contribuyen a liberar compuestos volátiles que mejoran el aroma y la complejidad de los vinos, partiendo de precursores no aromáticos. 

Por ejemplo, en el caso de Debaryomyces, una cepa de Debaryomyces vanriji aislada de uva, en estudios en cocultivo con S. cerevisiae permitió obtener vinos con un incremento en geraniol que se ligó a la acción de la β-D-glucosidasa. En fermentaciones con chardonnay, el cocultivo con la cepa industrial de S. cerevisiae VIN13 de una cepa de Debaryomyces pseudopolymorphus incrementó las concentraciones de citronellol, nerol y geraniol.

También existen ejemplos de aumento de tioles volátiles cuando se usa una cepa de Candida zemplinina, aunque en este caso son otros los enzimas implicados. En algunos casos, estos estudios han dado lugar a la comercialización de cepas que ya se pueden encontrar en el mercado, como es el caso de una cepa de Metchnikovia pulcherrima y otra de Pichia kluyveri, ambas recomendadas por el impacto positivo que tienen sobre la generación de terpenos y tioles (Padilla et al. 2016).

Es importante recordar que existen levaduras dentro del género Saccharomyces, distintas de S. cerevisiae, que también producen estos enzimas (Saccharomyces ludwigii, Saccharomyces pararoseus). No hay que olvidar que, aunque se habla de las no-Saccharomyces como alternativas a S. cerevisiae como cultivos iniciadores, existen grupos de investigación en España que investigan sobre otras levaduras del género Saccharomyces, cuyos estudios muestran que también pueden aportar interesantes características al vino (Gamero et al. 2013).

«En cultivos mixtos con T. delbrueckii se ha visto en diferentes estudios que reducen la producción de la acidez volátil y el acetaldehído.» .
 

Los cocultivos de no-Saccharomyces con S. cerevisiae también se han usado para controlar la acidez volátil en el vino. En cultivos mixtos con T. delbrueckii se ha visto en diferentes estudios que reducen la producción de la acidez volátil y el acetaldehído, incluso partiendo de mostos botritizados.

A pesar de que el impacto de los cultivos mixtos se ha estudiado principalmente por la capacidad de las no-Saccharomyces para influir sobre la composición aromática, existen numerosos trabajos que ponen el foco sobre otros metabolitos importantes en la fermentación. En el caso del glicerol, se ha visto que cepas de C. zemplinina producen vinos con mayor cantidad de este metabolito o que el cocultivo con cepas de Pichia fermentans o L. thermotolerans producen menos ácido acético y un incremento de la acidez volátil junto al glicerol. Existen también ejemplos de cómo las no-Saccharomyces pueden ser beneficiosas para incrementar la producción de manoproteínas, o actuar positivamente sobre la estabilización del color, incluso en vinos espumosos, mejorando las características de la espuma (Medina-Trujillo et al. 2017).

No-Saccharomyces y vinos con menor grado alcohólico

Recientemente el empleo de las no-Saccharomyces se ha propuesto para disminuir el grado alcohólico. Las diferencias metabólicas que existen entre las no-Saccharomyces y S. cerevisiae hacen que estas levaduras puedan suponer una mejor alternativa al intento de disminuir el grado alcohólico mediante el uso de cepas de S. cerevisiae que tengan una menor producción de etanol. Al fin y al cabo, los fenómenos de domesticación y adaptación a la fermentación alcohólica y la producción de vino de S. cerevisiae, la han convertido en una de las levaduras con mayor eficiencia alcohólica. Siendo por tanto más interesante buscar en la diversidad de las no-Saccharomyces una respuesta a la reciente problemática del aumento del grado alcohólico.

En nuestro grupo hemos desarrollado y optimizado un protocolo para la inoculación secuencial de cepas de levaduras pertenecientes a T. delbrueckii y M. pulcherrima junto a S. cerevisiae para obtener vinos con menor grado alcohólico. Durante los primeros días de fermentación y mediante el uso de aireación, permitimos a las no-Saccharomyces respirar en vez de fermentar los azucares de la uva. Una vez se han consumido parte de estos azúcares, inoculamos la cepa de S. cerevisiae que resulte más interesante, y trabajamos en condiciones de fermentación convencionales. El objetivo es obtener no solo vinos con menor grado alcohólico, sino más diversos en aromas, y que proporcionen un mayor grado de complejidad. No se trata de desalcoholizar el vino, sino de bajar entre uno y tres grados, disminuyendo así los efectos negativos que el alcohol tiene sobre el paladar y la salud (González et al., 2013; Morales et al., 2015). Un resumen de este trabajo se puede encontrar en Acenologia 27.5.2015).

 

Las fermentaciones mixtas esconden interesantes sorpresas

Por otro lado, el uso de cultivos mixtos de levaduras supone un nuevo reto desde el punto de vista científico, el de entender qué es lo que está ocurriendo en estas poblaciones de levaduras en las que encontramos de forma abundante más de una especie. En este sentido, nuestro grupo lleva un tiempo estudiando cuál es el efecto que el cocultivo produce sobre el comportamiento de las levaduras en el mosto.

Ya se sabía que existen diversos tipos de interacciones entre levaduras (Wang et al. 2015, 2016), generalmente afectando de forma negativa a las no-Saccharomyces, que normalmente desaparecen de la fermentación y son desplazadas por S. cerevisiae. Este desplazamiento se debe en parte a que posee una mayor capacidad fermentativa y de consumo de azúcares, y en parte a su capacidad de tolerar mayores concentraciones de alcohol. Ahora también se sabe que, además de los conocidos factores killer de S. cerevisiae, esta levadura tiene otras estrategias para imponerse en la fermentación, como la producción de pequeños péptidos, derivados de enzimas (con una actividad descrita muy diferente) que poseen actividad antimicrobiana contra diversas especies de levaduras y bacterias.

En nuestro grupo hemos observado, mediante la monitorización de cultivos mixtos de T. delbrueckii y S. cerevisiae, que existía un aumento anormal de la producción de CO2 tras el arranque de la fermentación. Para entenderlo mejor utilizamos la secuenciación de nueva generación (NGS), aprovechando también la reciente publicación del genoma de T. delbrueckii, para hacer un estudio de la reconfiguración transcripcional que ocurría cuando S. cerevisiae y T. delbrueckii arrancaban una fermentación en cocultivo, comparado con el arranque en solitario.

«Hay que explorar si la combinación de determinadas especies en los arranques de fermentación puede ser una estrategia para disminuir los tiempos de fermentación... aportando un perfil aromático diferente.» .
 

Los resultados de este estudio transcriptómico demostraron que T. delbrueckii inducía en S. cerevisiae un aumento de la expresión de los genes relacionados con la fermentación de azucares (ruta de glucofermentación) y que este efecto también ocurría a la inversa en T. delbrueckii al crecer con S. cerevisiae (Tronchoni et al. 2017). Por tanto, el hecho de tener un importante competidor en el entorno como es T. delbrueckii, una especie de levadura que ha demostrado tener buenas características fermentativas, produce en S. cerevisiae una aceleración del metabolismo, probablemente debido a la competición por nutrientes. Habría que explorar si la combinación de determinadas especies en los arranques de fermentación puede ser una estrategia para disminuir los tiempos de fermentación, así como su eficiencia. Además, aporta un perfil aromático diferente.

Hemos estudiado otras especies de no-Saccharomyces y hemos visto que el resultado es similar pero no igual, siendo de momento esta cepa de T. delbrueckii la que más acelera el metabolismo de S. cerevisiae. Es posible que no se trate de un resultado con el que se pueda generalizar y que diferentes composiciones de microorganismos, promuevan diferentes resultados, debido a las condiciones en las que se establecen estas interacciones entre las dos levaduras.

 

Puntos críticos susceptibles de mejora

El empleo de no-Saccharomyces como cultivos iniciadores en enología tiene una serie de problemas que necesitan mejorar, o aspectos que no son lo eficientes que sería deseable. El primer problema que puede encontrar un enólogo que se interese por alguna cepa de no-Saccharomyces es la accesibilidad a estas cepas. A pesar de que el mercado evoluciona rápidamente, y cada año aparecen más cepas en las colecciones de las diferentes empresas, es tan alta la diversidad de las no-Saccharomyces que aparecen cada año en diferentes investigaciones, mostrando aspectos o proponiendo aplicaciones interesantes, que resulta imposible para las empresas actualizarse al mismo ritmo. Además, como hemos comentado antes, no siempre es una tarea fácil conseguir condiciones de producción eficientes para estas no-Saccharomyces. Aunque exista la opción de encargar estas cepas a pequeñas empresas o centros de investigación, para disponer de un producto único, se trata de una opción costosa.

«La diversidad de las no-Saccharomyces que aparecen cada año en diferentes investigaciones, mostrando aspectos o proponiendo aplicaciones interesantes, es muy alta.»

 

El control de la imposición y el seguimiento de la fermentación puede ser otro de los principales problemas. Estas cepas no tienen la capacidad fermentativa de S. cerevisiae y, por tanto, su imposición va a ser más problemática que en el caso de la levadura estándar. Al mismo tiempo, será conveniente un seguimiento microbiológico de la situación de la levadura en la fermentación. Dependiendo de las características de la no-Saccharomyces seleccionada, el seguimiento podrá ser más sencillo o más complicado. Desde recuentos en placas en diferentes condiciones (medios de cultivo o temperaturas) que permitan discernir entre una u otra levadura, hasta métodos de identificación moleculares (RFLP, elementos delta, SNP, etc.). Cualquiera de las opciones requiere disponer de laboratorio equipado para análisis microbiológicos y de microbiología molecular, o externalizar los análisis.

Respecto a la imposición, cabe destacar que una de las razones por las que S. cerevisiae se impone con mayor facilidad en las fermentaciones es porque años de domesticación por parte de los bodegueros han seleccionado levaduras que son capaces de resistir un potente agente antimicrobiano, el anhídrido sulfuroso; agente al que la mayoría de las cepas de no-Saccharomyces son sensibles. Será necesario adaptar el sulfitado si decidimos usar estas especies. De hecho, el uso de no-Saccharomyces se ha propuesto también como apoyo a la elaboración de vino sin sulfuroso. Igualmente, como se ha indicado antes, es necesario adaptar la pauta de adición de nutrientes de fermentación, para evitar paradas de fermentación en la segunda etapa de fermentaciones secuenciales.

En general, los criterios de selección de cepas de levaduras no-Saccharomyces para el desarrollo de estos nuevos cultivos iniciadores se basan en su comportamiento en cultivos puros, ya sea en medios sintéticos o en mostos naturales. Estos estudios, que son necesarios en una primera fase de cualquier proceso de selección, permiten obtener una primera impresión de las potencialidades de las levaduras. Sin embargo, en condiciones reales de utilización, incluso aunque se trate de inoculación secuencial, se van a producir interacciones entre las diferentes levaduras implicadas. Algunos ejemplos de estas interacciones se han descrito antes.

Estas interacciones no solo afectan a la dinámica de poblaciones, sino a los metabolitos que se producen. Y tampoco son unidireccionales, sino que tanto S. cerevisiae como las no-Saccharomyces pueden modificar su perfil metabólico cuando participan en la misma fermentación. Por lo tanto, es necesario tener en cuenta estas posibilidades en el desarrollo de nuevas levaduras comerciales, así como conocer la compatibilidad entre cepas o especies de levaduras, o al menos cuáles son las consecuencias de su utilización conjunta, más allá de las potencialidades que se aprecian cuando se utilizan por separado.

 

Conclusión

El empleo de las no-Saccharomyces se está extendiendo, en parte gracias a que responde a una de las demandas del mercado, la de disponer de productos con un perfil y una imagen más “natural” o tradicional, y más parecidos a los derivados de fermentaciones espontáneas. Además, el empleo de estas no-Saccharomyces abre todo un abanico de posibilidades de mejora del vino, tanto en los aspectos mencionados aquí (aroma, acidez, glicerol, manoproteínas, color o grado alcohólico), como en otros que revelen en el futuro, ya que, debido a su potencial, son muchos los grupos de investigación trabajando con estas levaduras.

Tal como hemos visto en nuestro grupo de investigación, hay indicios de que el empleo de mezclas de levadura como cultivos iniciadores puede suponer más ventajas de las que a priori se pensaba, al conseguir arranques de fermentación más sólidos y eficientes. En cualquier caso, el estudio de las interacciones entre los cultivos iniciadores utilizados en la misma fermentación va a ser crucial para mejorar el control de la fermentación en estas nuevas condiciones.

 
Agradecimientos

El trabajo en nuestro grupo está financiado por los proyectos MINECO/FEDER RTC-2014-2186-2 y AGL2015-63629-R (MINECO/FEDER, UE); y el proyecto de la UE YeSVitE (7FP-IRSES-GA n.° 612441).

 

Bibliografía

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Gonzalez R, Quirós M, Morales P. Yeast respiration of sugars by non-Saccharomyces yeast species: a promising and barely explored approach to lowering alcohol content of wines. Trends Food Sci Tech 2013; 29: 55-61.

Medina-Trujillo L, Gonzalez-Royo E, Sieczkowski N, Heras J, Canals JM, Zamora F. Effect of sequential inoculation (Torulaspora delbrueckii/Saccahromyces cerevisiae) in the first fermentation on foaming properties of sparkling wine. Eur Food Res Technol 2017; 243: 681-8.

Morales P, Rojas V, Quirós M, Gonzalez R. The impact of oxygen on the final alcohol content of wine fermented by a mixed starter culture. Appl Microbiol Biotechnol 2015; 99: 3993-4003.

Tronchoni J, Curiel JA, Morales P, Torres-Perez R, Gonzalez R. Early transcriptional response to biotic stress in mixed starter fermentations involving Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii. Int J Food Microbiol 2017; 241: 60-8. 

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