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CIENCIA Y TECNOLOGÍA OTROS ARTÍCULOS CIENTÍFICOS  
Avances en la cromatografía de gases aplicada al análisis
de compuestos volátiles en el vino
Ricardo López y Juan Cacho
riclopez@unizar.es
Laboratorio de Análisis del Aroma y Enología
Departamento de Química Analítica. Facultad de Ciencias
Aragon Institute of Engineering Research I3A
Universidad de Zaragoza

El aroma del vino es uno de los más complejos que existen en la naturaleza por diversas razones. En primer lugar, por el gran número de sustancias volátiles que se encuentran en la composición del vino; en segundo, por la naturaleza cambiante de la composición debida a la propia evolución del vino; en tercer lugar, por la gran variedad de vinos que podemos encontrar y, por último, porque, en la mayoría de los vinos, su aroma característico no es debido a un compuesto impacto, sino a la acción de varios componentes químicos actuando conjuntamente (Ferreira et al. 2009).

Además se debe tener en cuenta que este grupo de componentes químicos no es homogéneo, ni desde el punto de vista de su naturaleza química, ni desde el de su contenido en el vino. Las familias implicadas en el aroma del vino van desde los conocidos alcoholes o ésteres, a los fenoles, enolonas o tioles polifuncionales entre otros. Más pronunciada es incluso la diferencia en las concentraciones, con variaciones de hasta once órdenes de magnitud: desde el etanol que se encuentra en gramos por litro hasta los pocos nanogramos por litro de la 4-mercapto-4-metil-2-pentanona.

El objetivo de este artículo es mostrar cómo esta complejidad, que se traduce en una gran dificultad en el análisis del aroma del vino, exige la aplicación de las últimas técnicas cromatográficas de las que dispone el químico analítico.

La cromatografía de gases ha sido durante las últimas décadas la técnica que mayor capacidad de separación ha proporcionado en el campo del análisis orgánico. El empleo generalizado de las columnas capilares a principios de los años ochenta trajo consigo una revolución en el poder de separación de mezclas complejas. Esto posicionó la cromatografía de gases como la técnica a elegir siempre que se analizaran sustancias volátiles. Sin embargo, pronto quedó claro que en algunos campos la capacidad de separación ofrecida por una única columna cromatográfica no era suficiente. Es el caso, entre otras, de la industria petrolífera, aplicaciones medioambientales o relacionadas con el aroma cuyos cromatogramas son altamente complejos, con multitud de coeluciones que interfieren en la determinación de las sustancias de interés. Por esta razón, los avances más relevantes en la cromatografía de gases en la última década han estado dirigidos a la obtención de una mayor capacidad de separación. En opinión de los autores, estos avances pueden dividirse en dos campos: la cromatografía de gases multidimensional convencional (GC-GC) y la cromatografía de gases multidimensional comprensiva (GCxGC). La otra gran fuerza, en parte relacionada con lo anterior, ha sido la necesidad de una mayor rapidez de los análisis cromatográficos y en este campo la evolución ha conducido hacia el desarrollo de la cromatografía de gases ultrarrápida (Fast-GC). A continuación se resumen los fundamentos de cada una y sus aplicaciones más relevantes en el campo del análisis del vino.


Cromatografía de gases ultrarrápida

Desde los comienzos de la cromatografía de gases ha habido un gran interés en aumentar la rapidez de separación de esta técnica. Las ventajas de aumentar la rapidez son claras, el número de muestras analizadas puede aumentar significativamente, con un menor coste por muestra asociado. Una mayor rapidez facilita la aplicación de la cromatografía de gases al control de calidad, y permite mejorar la precisión de los análisis mediante el análisis de réplicas en el tiempo que costaría un solo análisis en cromatografía de gases convencional. Cuando se enfrenta el problema de reducir el tiempo de una separación cromatográfica existen diversas opciones, que van desde lo obvio a lo más complejo (Korytar et al. 2002). En la primera categoría se puede incluir reducir la resolución a un valor que sea justo el suficiente para obtener la separación. Este debería ser a priori el objetivo de todo cromatografista y las opciones comprenden reducir la longitud de la columna, trabajar por encima de la velocidad óptima del gas portador o utilizar algún tipo de detección selectiva, entre otras.

Sin embargo, es la segunda categoría, implementar un método que reduzca el tiempo de análisis pero con una resolución constante, la que puede ser más novedosa en el contexto actual. Dentro de este grupo la opción más lógica para conseguir una cromatografía de gases más rápida es la utilización de columnas con un diámetro interno (d.i.) reducido. La ganancia en velocidad es proporcional a la reducción en el d.i. de la columna pero desafortunadamente su aplicación no está libre de problemas. La inyección en columnas de d.i. reducido (<150 ?m) es crítica y los volúmenes muertos debe ser mínimos. Incuso el más pequeño volumen muerto puede traducirse en picos con colas debido al bajo flujo con el que se trabaja. Además las bajas capacidades de carga de estas columnas conllevan que para inyectar en bandas estrechas el volumen de inyección se reduzca, lo que hace empeorar los límites de detección. En cuanto a los requerimientos instrumentales, la utilización de estas columnas supone una gran caída de presión por lo que se requieren cromatógrafos que puedan alcanzar presiones de cabeza elevadas. Otro requerimiento importante es disponer de un detector suficientemente rápido para poder obtener suficientes puntos de los picos cromatográficos.

Hoy en día, columnas con d.i. en el rango de 100 a 200 μm están disponibles comercialmente en una gran variedad de fases estacionarias, aunque también existen columnas con d.i. de 50 μm con una disponibilidad de fases más limitada. Las columnas de 100 μm suponen un buen compromiso entre tiempo de análisis y compatibilidad instrumental. A modo de ejemplo, en nuestro laboratorio hemos aplicado esta técnica a la mejora del método de análisis de compuestos mayoritarios del aroma del vino (Ortega et al. 2001). Originalmente el método de análisis se realizaba en una columna de 50 m x 0,32 mm d.i. y la duración del cromatograma era de 60 min. Actualmente empleamos una columna de 10 m x 0,1 mm d.i. con la misma fase estacionaria y la duración del cromatograma es de 9 min sin pérdida de resolución entre los picos. En nuestro conocimiento hay pocos ejemplos de la aplicación de la cromatografía de gases rápida al vino. Uno de ellos, en el que la velocidad de análisis era clave, fue la monitorización de los volátiles del vino durante el proceso de fermentación (Vas et al. 1999).


Cromatografía de gases multidimensional convencional (GC-GC)

El desarrollo y utilización de la cromatografía de gases multidimensional (MDGC) corresponde a la necesidad, ya mencionada, de incrementar el poder de separación de la cromatografía de gases. La propiedad que define la cromatografía de gases multidimensional es el requerimiento de que todos los analitos de interés sean sometidos a dos etapas de separación independientes y que los analitos permanezcan separados hasta que se complete todo el análisis. Esencialmente, lo que esto significa es que el efluente de la primera columna cromatográfica es reanalizado por una segunda columna con un fase estacionaria de diferente selectividad. En el caso de la cromatografía de gases multidimensional convencional o heart-cut (GC-GC) solo parte del efluente de la primera columna es cromatografiado en la segunda, mientras que en la cromatografía de gases multidimensional comprensiva o completa (GCxGC) todo el efluente de la primera columna es cromatografiado en la segunda. En el presente apartado se tratará la instrumentación necesaria y las aplicaciones al vino de la GC-GC, y en el siguiente apartado se tratará la GCxGC.

La configuración básica instrumental para llevar a cabo la GC-GC consiste en un sistema cromatográfico compuesto de dos hornos independientes, cada uno con una de las columnas analíticas, y varios detectores. Generalmente con un detector FID en el primer horno y un espectrómetro de masas en el segundo cromatógrafo. La pieza clave en el sistema es el dispositivo que permite la conexión de las dos columnas En el caso más habitual se trata de una válvula tipo Deans (Deans 1968), que mediante el control de los flujos y presiones del sistema permite el envío selectivo de fracciones de efluente desde la primera hacia la segunda columna. También puede ser necesario, según las configuraciones, un punto de criofocalización al inicio de la segunda columna para favorecer el estrechamiento de las bandas cromatográficas en el segundo horno.

La técnica de GC-GC está bien asentada en el análisis del aroma del vino. Ha sido aplicada al vino en repetidas ocasiones por diversos autores. Nitz y colaboradores para caracterizar la presencia de aromas artificiales en vinos de frutas (Nitz et al. 1989). En 1990, Herraiz et al. estudiaron la aplicabilidad de la cromatografía multidimensional para evaluar la calidad del Pisco chileno (Herraiz et al. 1990). Martin y Etievant desarrollaron un método GC-GC para la determinación cuantitativa del sotolón (Martin et al. 1991), y más recientemente Culleré y colaboradores validaron un método cuantitativo para la determinación de alquilmetoxipirazinas (Culleré et al. 2009). La GC-GC con una segunda columna enantioselectiva se ha utilizado en otros trabajos con el propósito de establecer controles de autenticidad (Mosandl et al. 1990; Hollnagel et al. 1991; Lehmann et al. 1993; Full et al. 1995; Masson et al. 1995; Barba et al. 2010), pero también con el objetivo de entender las rutas bioquímicas (Bouchilloux et al. 2000; Fernandes et al. 2003; Pons et al. 2010). Otros ejemplos de su gran utilidad pueden encontrarse en el campo de la identificación de nuevos odorantes en el vino: los compuestos impacto responsables del olor de las uvas infectadas por Oidio (Darriet et al. 2002), los ésteres minoritarios con alto impacto sensorial en vinos blancos especiales (Campo et al. 2006; Campo et al. 2006; Campo et al. 2007), los compuestos responsables del olor a ciruelas maduras en vinos prematuramente envejecidos (Pons et al. 2008), o el 2-metil-3-(metilditio)furano en vinos monovarietales canarios (Culleré et al. 2008). En la mayor parte de estas últimas referencias el sistema multidimensional se combinó con detección olfatométrica simultánea para una mayor capacidad de discriminación de los odorantes importantes.


Cromatografía de gases multidimensional comprensiva (GCxGC)

Como se comentó en el apartado anterior la GCxGC implica que todo el efluente de la primera columna sea cromatografiado en la segunda. Sin embargo, unir simplemente las dos columnas no es suficiente para conseguir la separación deseada, ya que en realidad equivaldría a mezclar las fases estacionarias. Para que el acoplamiento suponga realmente un incremento en la capacidad de separación se debe incorporar un sistema modulador entre las dos columnas que permita el aislamiento de zonas del efluente de la columna 1 y el paso posterior a la columna 2. Este modulador es la pieza clave de un sistema GCxGC y con el paso del tiempo ha ido evolucionando a sistemas más robustos como los disponibles comercialmente a día de hoy, que en su mayor parte se basan en sistemas de criofocalización doble (Marriott 2002). La separación puede realizarse en único horno cromatográfico, ya que la segunda columna es una columna de tipo ultrarrápido como las descritas en el apartado 1. Otro punto de vital importancia para realizar una separación GCxGC con éxito es que las fases estacionarias de las dos columnas sean lo más diferentes posible para conseguir la máxima separación posible. Si estos requisitos se cumplen, en teoría, la capacidad de separación del sistema se multiplica y pasamos a obtener un cromatograma tridimensional (o incluso cuadrimensional si se emplea un espectrómetro de masas como detector).

Los trabajos científicos de aplicación de la GCxGC al vino son bastante recientes y en su mayoría están dirigidos a analitos muy concretos. Son los casos de la determinación de alquilmetoxipirazinas en vino (Ryan et al. 2005; Ryona et al. 2008; Schmarr et al. 2010) o en uvas (Ryona et al. 2009; Ryona et al. 2010) y también se ha aplicado a la cuantificación de etil carbamato (Perestrelo et al. 2010). Solo se han publicado por el momento tres trabajos que hayan utilizado el potencial de la técnica para identificar nuevos compuestos y perfilar los volátiles del vino. Rocha y colaboradores utilizaron la GCxGC para analizar monoterpenos en uvas de la variedad fernao-Pires, identificando 56 monoterpenos, de los cuales 20 se describían por primera vez en las uvas (Rocha et al. 2007). En este trabajo se destaca una de las ventajas de la GCxGC, que la separación de compuestos se hace por familias, facilitando la identificación de los mismos. Otra aplicación interesante de la GCxGC es la llevada a cabo recientemente por Schmarr y colaboradores para seguir de forma rápida los cambios producidos por la microoxigenación en el vino, en este caso combinando la ingente cantidad de información producida con técnicas de análisis multivariante (Schmarr et al. 2010). Por último, y en la misma línea de análisis del mayor número de volátiles posibles, Robinson y colaboradores han empleado la técnica para analizar de manera simultánea más de 350 volátiles del vino (Robinson et al. 2010).


Conclusiones

La necesidad de entender y controlar las diferencias sensoriales en el aroma del vino demanda de los métodos de análisis, y en particular de la cromatografía, una mayor rendimiento. Tanto en lo referente a la capacidad de analizar un mayor número de volátiles, como en hacerlo en menor tiempo y en más bajas concentraciones. Las técnicas cromatográficas tratadas en este artículo buscan satisfacer estas necesidades, ya sea aumentando la velocidad de los análisis (GC ultrarrápida), o aumentando la capacidad de separación y detección (GC-GC y GCxGC). Cabe esperar en un futuro cercano, que en particular la GCxGC proporcione avances significativos en este campo. Por una parte, en la identificación de nuevos compuestos que hasta el momento han quedado sin resolver utilizando la cromatografía tradicional, y por otra, en la reducción de los tiempos de análisis mediante la disminución del tratamiento de muestra necesario gracias a su gran capacidad de separación.

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[28.02.11]