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CIENCIA Y TECNOLOGÍA OTROS ARTÍCULOS CIENTÍFICOS  

Conocimientos actuales sobre la hidrólisis de los compuestos glucosídicos en los vinos

Juan Cacho
Departamento de Química Analítica. Laboratorio de Análisis del Aroma y Enología
Instituto de Investigación en Ingeniería de Aragón (I3A). Facultad de Ciencias
Universidad de Zaragoza
jcacho@unizar.es

El aroma del vino es uno de los factores más importantes que determinan su carácter y su calidad. La generación de este aroma es un proceso muy complejo, en el que intervienen un gran número de reacciones químicas y enzimáticas. Está universalmente aceptado que los compuestos que provienen de la uva, y su perfil, juegan el papel más decisivo en la expresión de las características aromáticas de la variedad. Estos compuestos constituyen lo que se denomina aroma varietal. Por tanto, el aroma varietal está formado por estos compuestos en su estado libre, por precursores específicos y por compuestos como los aminoácidos o los ácidos grasos, cuyo perfil es característico de la variedad.

Entre los precursores específicos de la uva se encuentran:

- Precursores cisteínicos y glutationílicos, a partir de los cuales se forman los tioles varietales.

- Precursores glucosídicos, que son el origen de terpenos, fenoles volátiles, alcoholes, norisoprenoides y otros compuestos.

La existencia de estos últimos precursores en la uva se conoce desde hace mucho tiempo y han sido identificados en otras frutas y legumbres. Los precursores glucosídicos están constituidos por una unidad oxídica unida por un enlace β-glucosídico a un compuesto volátil denominado aglucona. En la uva los precursores glucosídicos constituyen una reserva potencial de aromas, que pueden liberarse por hidrólisis durante la vinificación o la crianza del vino. Esta hidrólisis puede ser ácida o enzimática, pero también los procesos metabólicos tienen una influencia importante. La hidrólisis ácida se produce de forma natural al pH del vino. Por otra parte, la hidrólisis enzimática puede tener lugar por los enzimas glucosídasicos que presenta la uva, las glucosidasas de las levaduras y de las bacterias, y por las glucosidasas de origen fúngico.

Objetivos

Una de las líneas de investigación de nuestro laboratorio tiene como objetivo estudiar y comprender los procesos por los que estos precursores glucosídicos se transforman para liberar los compuestos odorantes y determinar su papel en el aroma del vino.

Este objetivo comprende:

1. Estudiar la hidrólisis por diferentes cepas de levaduras y de bacterias, sobre la fracción de precursores glucosídicos en el transcurso de las fermentaciones alcohólica y maloláctica. Determinar cuáles son las moléculas aromáticas formadas y estudiar su efecto sensorial.

2. Comparar estrategias de hidrólisis rápida de precursores con las que realizan las levaduras en el transcurso de la fermentación alcohólica y evaluar su poder predictivo para medir el potencial aromático de la uva.

3. Estudiar la liberación y formación de aromas a partir de sus precursores en el transcurso de la crianza del vino, tanto en presencia como en ausencia de lías.

En este artículo se van a mostrar trabajos que han constituido la tesis doctoral de Natalia Loscos.

Liberación de aromas a partir de precursores en el transcurso de la fermentación alcohólica1

Hasta hace poco tiempo, el papel de las levaduras en la hidrólisis de precursores no estaba claro, ya que los trabajos publicados eran en cierto modo contradictorios. A pesar de que la actividad glucosidásica se había demostrado en levaduras comerciales, la estabilidad de esta actividad se había descrito limitada a las condiciones de vinificación. Este trabajo y el de Ugliano et al.2 han puesto en evidencia que las levaduras comerciales del género Saccharomyces son capaces de liberar y de formar compuestos odorantes a partir de sus precursores glucosídicos en el transcurso de la fermentación alcohólica.

En este trabajo, hemos realizado la fermentación alcohólica utilizando un mosto natural, con y sin adición de un extracto de precursores glucosídicos. Se han utilizado tres levaduras del género Saccharomyces. Tras la fermentación los vinos se han caracterizado por vía analítica y sensorial.

Se han analizado un total de 64 compuestos odorantes, de entre los cuales 51 modificaron su concentración por adición de precursores. En la mayoría de los casos, la adición de precursores ha inducido un aumento de la concentración de compuestos odorantes en los vinos estudiados. Sin embargo, en algunos casos (como por ejemplo, los ácidos 3-metil y 2-metilbutírico y el Z-3-hexen-1-ol) la adición de precursores ha provocado una disminución de la concentración en comparación con los vinos sin adición de precursores. Este último comportamiento podría deberse a la interferencia que causa la adición de fracciones de precursores en la síntesis de compuestos, principalmente de origen fermentativo. Los aumentos de concentración más importantes se han observado en el caso de los derivados de la vainillina (vainillato de metilo, vainillato de etilo, acetovainillona y acetosingerona), ciertos bencenos (cinamato de etilo, dihidrocinamato de etilo y dihidrometileugenol), ciertos fenoles volátiles (guayacol y m-cresol) y ciertos norisoprenoides (actinidoles, 3-oxo-α-ionol, β-ionona). En la mayor parte de los casos, el aumento de concentración observado no sobrepasó el umbral de percepción olfativa (salvo en el caso de la β-damascenona, β-ionona y vinilfenoles); no obstante, se ha constatado que ciertos grupos de compuestos (lactonas, cinamatos, derivados de la vainillina y terpenos) ejercen una acción simultánea sobre el aroma. Debido a esto, la adición de precursores ha entrañado un incremento de la nota floral de los vinos al final de la fermentación alcohólica.

Comparación de la capacidad de diferentes cepas de levaduras para liberar aromas varietales a partir de precursores3

Después de haber comprobado que las levaduras del género Saccharomyces eran capaces de hidrolizar precursores glucosícidos en el transcurso de la fermentación alcohólica, hemos realizado un estudio para comparar la actividad enzimática y la capacidad de diferentes cepas de levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces para liberar aromas a partir de un extracto de precursores. Ciertos autores4 habían demostrado que ciertas cepas del género no Saccharomyces presentaban una actividad enzimática superior a las del género Saccharomyces, y que eran capaces de liberar cantidades más importantes de ciertos compuestos odorantes. Sin embargo, las condiciones operatorias utilizadas en este estudio eran las condiciones óptimas para la liberación de esos compuestos por acción de las glucosidasas (incubación a pH 5, 30 ºC).

Por el contrario, para profundizar en estos conocimientos, nosotros hemos realizado el estudio comparativo en el transcurso de la fermentación alcohólica, de un mosto modelo enriquecido en glucósidos en condiciones estándar de vinificación (100 g/L glucosa, 100 g/L fructosa, 20 ºC, pH 3,5). Los vinos obtenidos en estas condiciones se han caracterizado por análisis sensoriales y los compuestos formados se han cuantificado por GC-MS.

Veintiuna de las cepas estudiadas ha mostrado actividad β-glucosidásica y doce de entre ellas han presentado una actividad intensa. Esta actividad hidrólica ha sido más frecuente en las cepas del género no Saccharomyces. Por lo que respecta al análisis sensorial, los vinos enriquecidos en precursores han mostrado un aumento de las notas de violeta, fruta exótica, flor de naranjo, pera, tostado y frutos secos, principalmente en el caso de levaduras del género Saccharomyces. En lo que se refiere a la liberación de aromas hemos comprobado grandes diferencias entre levaduras, demostrando que el género de la levadura tiene una influencia crítica en los contenidos de la mayoría de los aromas varietales.

Por ejemplo, la cepa de Torulaspora ha presentado los contenidos más elevados en riesling acetal, vainillato de etilo, ciertas lactonas (γ-nanolactona y γ-decalactona) dihidrocinamato de etilo y farnesol. Por otra parte, los vinos obtenidos con las cepas de Brettanomyces poseían los contenidos más importantes en 4-etilguayacol, 4-etilfenol y los ácidos 3-metil y 2-metilbutírico. Los vinos obtenidos con las cepas del género Saccharomyces han sido los más ricos en β-damascenona, β-ionona, linalol y vinilfenoles. La mayoría de estos compuestos, salvo los etil y vinilfenoles, han sido liberados en concentraciones relativamente bajas, pero suficiente para causar efectos sensoriales significativos.

Liberación de aromas varietales a partir de precursores en el transcurso de la fermentación maloláctica5

Estudios anteriores han demostrado que las bacterias del género Oenococcus oeni poseen actividad glucosidásica6 y son capaces de transformar los precursores glucosídicos de la uva liberando los aromas varietales en el transcurso de la fermentación maloláctica, tanto en vinos modelo como en vinos reales.7,8 De cualquier forma, se ha publicado poca información sobre la capacidad hidrolítica de las cepas del género Lactobacillus y Pediococcus. A pesar de que su actividad β-glucosidásica se ha demostrado,9 su capacidad para liberar aromas a partir de los precursores glucosídicos no se ha estudiado.

En consecuencia, en este trabajo hemos estudiado la actividad β-glucosidásica de diversas cepas de bacterias lácticas del género O. oeni, Lactobacillus y Pediococcus. Se seleccionaron las cepas que presentaron la actividad β-glucosidásica más fuerte, con el fin de estudiar su capacidad para liberar aromas en el transcurso de la fermentación maloláctica, de un vino modelo enriquecido en precursores glucosídicos. Después de la fermentación maloláctica, los vinos se caracterizaron por análisis sensorial y los compuestos volátiles formados se cuantificaron por GC-MS.

No se encontró actividad β-glucosidáctica en las cepas estudiadas del género Pediococcus, mientras que ciertas cepas del género Lactobacillus y O. oeni mostraron una actividad intensa. Estas cepas han sido capaces de liberar cantidades pequeñas de terpenos, de C-13 norisoprenoides, de fenoles volátiles y de derivados de la vainillina, aunque no hubiera tenido lugar la fermentación maloláctica (como en el caso de las cepas del género Lactobacillus). En general, los vinos inoculados con las cepas del género O. oeni presentan concentraciones mayores en aromas varietales que las inoculadas con las cepas del género Lactobacillus, en particular para ciertos derivados de la vainillina (vainillina, vainillato de etilo, aceto-vainillona y siringaldehído) 4-vinilfenol y γ-decalactona. No obstante, los vinos obtenidos con una de las cepas de Lactobacillus presentaban contenidos similares a los de las cepas de O. oeni. Por lo que respecta a los análisis sensoriales, los vinos enriquecidos en glucósidos mostraron un aumento de las notas verdes, de violeta, especiadas y oxidadas como consecuencia de la acción de las bacterias sobre el pool de precursores.

Comparación de diferentes estrategias de hidrólisis rápidas para medir el potencial aromático de la uva10

La mayor parte de los métodos utilizados para la cuantificación de la fracción de precursores glucosídicos de la uva, son métodos indirectos basados en el análisis de los compuestos odorantes liberados tras la hidrólisis ácida rápida o enzimática, utilizando preparaciones enzimáticas de origen microbiano. Por esta razón, las características más importantes de estas dos estrategias se conocen bien. Sin embargo, aunque existen estudios comparativos sobre los compuestos liberados por estos dos tipos de hidrólisis,11,12 así como de estudios que comparan la hidrólisis enzimática realizada por las preparaciones enzimáticas y la llevada a cabo por las levaduras,13 el número de trabajos en los que se unen los aromas liberados por estos dos tipos de hidrólisis rápida con los aromas que aparecen tras la fermentación alcohólica, son bastante escasos.14 En este trabajo, nosotros hemos estudiado estas dos estrategias de hidrólisis rápida, para determinar cuál es la más adecuada para medir el potencial aromático de la uva.

Para ello, hemos utilizado siete variedades de uva, en las que la fracción de precursores glucosídicos se ha extraído siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Estos extractos se han hidrolizado por vía ácida y enzimática, y se han añadido a un mosto sintético (200 g/L de glucosa) que fermentó a 20ºC. Los aromas liberados se analizaron por GC-MS siguiendo la metodología explicada anteriormente.

Las diferencias entre variedades no fueron muy marcadas, salvo en el caso de moscatel, chardonnay y garnacha. El moscatel presentó los contenidos más elevados en terpenos, el chardonnay las concentraciones más importantes en ciertos norisoprenoides (TPB, 3-oxo-α-ionol, 3-oxo-β-ionona y actinidoles) dihidrocinamato de etilo y γ-nonalactona; y finalmente la garnacha que presentó los contenidos más elevados en ciertos derivados de la vainillina (vainillato de metilo, acetovainillona, zingerona y siringaldehído) y en 4-vinilguayacol.

Por lo que respecta a las estrategias de hidrólisis, la fermentación alcohólica mostró una capacidad relativamente baja para liberar aromas varietales a partir de la fracción de precursores. Esto confirma que una parte del potencial aromático contenido en la uva permanece en su forma glucosídica tras la fermentación alcohólica. Por otra parte, la hidrólisis enzimática fue, generalmente, la más eficaz para liberar la mayoría de los aromas varietales, particularmente, en el caso de los fenoles volátiles, de los derivados de la vainillina, del alcohol bencílico y del 3-oxo-α-ionona. La hidrólisis ácida mostró un poder hidrolítico intermedio, pero fue la más eficaz para la formación de C-13 norisoprenoides. Esta estrategia de hidrólisis ha permitido predecir los contenidos de diversos aromas importantes de un vino (como el linalol, el α-terpineol, la β-damascenona, los vinilfenoles y los derivados de la vainillina). Por el contrario alguno de los aromas liberados por hidrólisis enzimática no son representativos de los aromas liberados en el transcurso de la fermentación.

Evolución de los aromas varietales durante la crianza del vino sobre lías

El hecho de que una parte del potencial aromático de la uva permanezca en su forma glucosídica tras la fermentación alcohólica hace que se pueda revelar en el curso del envejecimiento del vino. Durante esta etapa, la acidez del vino provoca la hidrólisis y la transformación lenta de los glucósidos y de las agluconas liberadas. Además, cuando el vino se cría sobre lías, los enzimas hidrolíticos liberados por autólisis de las levaduras pueden reaccionar con la fracción de los precursores glucosídicos. Los trabajos publicados sobre este tema no son muy abundantes. Aunque se ha observado una disminución de los contenidos totales en glucósidos después del contacto del vino con las lías,15 nosotros no tenemos información sobre los aromas liberados y sobre el papel de las lías en esta liberación. Por eso hemos estudiado la evolución de los aromas varietales en el transcurso de la crianza del vino sobre lías.

Después de la fermentación alcohólica de un mosto natural enriquecido en precursores glucosídicos, los vinos han permanecido en contacto con sus lías durante 9 meses a 20 ºC. Los compuestos odorantes formados se han cuantificado por GC-MS en momentos diferentes del envejecimiento (al final de la fermentación, después de tres meses y después de nueve meses). Se han observado dos comportamientos distintos: ciertos compuestos han mostrado un aumento en su concentración a lo largo del tiempo, es el caso de la mayoría de los norisoprenoides (salvo la β-damascenona y la β-ionona), linalol, α-terpineol, vainillato de etilo, siringaldehído y cinamato de etilo; mientras que la mayoría de los compuestos han mostrado una disminución de su concentración (particularmente los vinilfenoles y hexanoles). Esta disminución se debe a la inestabilidad de estos compuestos, la cual en ciertos casos aumenta en presencia de lías, lo que hace que su degradación no se compense por su formación a partir de los precursores. En la mayoría de los casos, la contribución de la hidrólisis ácida a la liberación de aromas varietales ha sido poco importante, salvo el caso del linalol, del α-terpineol y del siringaldehído.

Por otra parte, las lías provenientes de levaduras distintas han mostrado capacidades ligeramente diferentes para liberar los aromas varietales. Sin embargo, estos fenómenos no son siempre representativos de los observados en el transcurso de la fermentación alcohólica.

Evolución de los aromas varietales a partir de precursores en el transcurso del envejecimiento acelerado del vino16

Para completar los trabajos anteriores, hemos estudiado la liberación de aromas varietales en el transcurso del envejecimiento acelerado de un vino (sin lías). Cuando el vino se calienta entre 40-50 ºC en ausencia de oxígeno, se reproducen las reacciones hidrolíticas que tienen lugar en el transcurso de la crianza del vino en botella. Estas reacciones comprenden tanto la hidrólisis de los glucósidos como la deshidratación, ciclación y reorganización de las agluconas liberadas, como es el caso de los monoterpenos y de los C-13 norisoprenoides. La formación y la transformación de estos dos grupos de compuestos en el transcurso del envejecimiento del vino se ha estudiado ampliamente. Sin embargo, se ha publicado poca información sobre compuestos como los derivados de la vainillina, los fenoles volátiles o las lactonas.

Los vinos utilizados en este trabajo provenían de la fermentación alcohólica de un mosto modelo enriquecido en precursores, que se habían obtenido según lo citado anteriormente. Estos vinos se han sometido a un envejecimiento acelerado a 50 ºC durante nueve semanas. Los aromas varietales formados se analizaron después de una semana, después de tres y después de nueve semanas.

Hemos observado un aumento en los contenidos de la mayoría de los aromas varietales en la primera semana de crianza. De todos modos, muchos de los vinos enseguida han comenzado a disminuir su concentración. Ciertos compuestos que no se habían detectado al final de la fermentación estaban presentes a concentraciones elevadas después de la primera semana de crianza (vitispiranos, TDN, TPB, riesling acetal, óxidos de linalol, furánicos, siringaldehído, etc.). Los únicos compuestos en los que la concentración aumentó durante todo el envejecimiento son la mayoría de los derivados de la vainillina, el guayacol, el 4-etilfenol y los óxidos de linalol. En general hemos observado una acentuación de las diferencias varietales en el curso de la crianza, las cuales no eran tan evidentes al final de la fermentación alcohólica. Estas diferencias varietales son representativas de las que se habían observado después de la hidrólisis ácida y enzimática de los extractos de precursores.

Nota

Este artículo está basado en la intervención del mismo autor en la Jornada titulada Proyecto Vinaromas: coloquio internacional sobre los aromas del vino, que tuvo lugar en Zaragoza el 22 de noviembre de 2012. Para más información sobre el proyecto visite www.projet-vinaromas.eu.

 

Bibliografía

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