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CIENCIA Y TECNOLOGÍA OTROS ARTÍCULOS CIENTÍFICOS  

Levaduras no Saccharomyces como herramientas para controlar el grado alcohólico de los vinos: importancia del oxígeno y la respiración

Pilar Morales, Manuel Quirós, María Virginia Rojas, Alda Rodrigues, Typhaine Raimbourg, Jordi Tronchoni, José Antonio Curiel y Ramón González
Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino
(CSIC-Universidad de La Rioja-Gobierno de La Rioja), Logroño
www.icvv.es/microwine

El aumento creciente del grado alcohólico probable en el momento de la vendimia es uno de los mayores retos derivados del cambio climático a los que se enfrenta la producción de vinos de calidad, especialmente en países de climas cálidos. Por un lado, el efecto diferencial del incremento de la temperatura sobre la maduración fenólica respecto a la tecnológica provoca un desequilibrio entre ambos procesos. Por otro lado, la demanda de los consumidores y las tendencias de mercado hacia vinos bien estructurados exacerban el problema y sitúa a los enólogos en la disyuntiva entre mantener el grado alcohólico bajo control o esperar a madurez fenólica más adecuada. El exceso de azúcares en el mosto se traduce en un incremento de problemas en la gestión de la fermentación, mientras que el incremento del grado alcohólico final da lugar a problemas en la comercialización de los vinos, debido a consideraciones relacionadas con la salud o la seguridad vial, el incremento de impuestos y aranceles, y otras trabas para la exportación. Además de todo lo anterior, un exceso de alcohol en el vino puede afectar negativamente a su calidad sensorial: se potencia la percepción del sabor amargo, se disminuye la astringencia y se modifica el aroma (por ejemplo, disminuye el aroma afrutado).

La industria y los investigadores están abordando este problema teniendo en cuenta todas las etapas del proceso. Esto incluye, por ejemplo, la selección de parcelas, variedades y clones más apropiados a las condiciones y mercados actuales; pero se trata de soluciones a largo plazo, poco apropiadas, por ejemplo, para viñas viejas que se plantaron en otro contexto y que están en su mejor momento de producción en cuanto a calidad. Otras soluciones pasan por el manejo del viñedo, la desalcoholización parcial, y el control del rendimiento alcohólico durante la fermentación (alcohol producido por gramo de azúcar consumido). Cada una de estas soluciones tiene ventajas e inconvenientes, y dado que la reducción del grado el alcohólico es un objetivo relativamente reciente, todas van a requerir investigaciones en los próximos años para poder consolidarse como alternativas viables para los productores.

Durante los primeros días de una fermentación espontánea se produce una sucesión de especies de levadura, hasta que S. cerevisiae se acaba imponiendo al resto, siendo la responsable de terminar el proceso. Por ese motivo, esta es la especie de elección para las fermentaciones inoculadas y entre los criterios de selección tradicionales para cultivos iniciadores figuraba precisamente el poder fermentativo. En respuesta a la inquietud por el incremento del grado alcohólico, algunos investigadores han tratado de modificar mediante ingeniería genética el metabolismo de esta especie, para convertir parte de los azúcares en productos distintos al etanol, como ácido láctico o glicerol. Además de los problemas comerciales a los que se enfrentaría un vino elaborado con levaduras modificadas genéticamente (también conocidas como transgénicas u OMG), los resultados de laboratorio con las cepas modificadas nunca han sido totalmente satisfactorios, generalmente por la producción de otros metabolitos distintos al deseado. Recientemente se ha conseguido modificar el metabolismo de cepas de esta especie por evolución dirigida con resultados algo más prometedores (en parte porque en este caso no son levaduras transgénicas), aunque con un impacto relativamente pequeño sobre el grado alcohólico.

De hecho, la opción de modificar el metabolismo de las levaduras para desviar parte de los azúcares hacia otra ruta metabólica es algo que parece razonable para conseguir una reducción del grado alcohólico sin incrementar el azúcar residual. Sin embargo, la pregunta crucial en este caso es: la presencia de qué producto sería tolerable en la concentración necesaria para alcanzar una reducción significativa del grado alcohólico. Por ejemplo, uno de los metabolitos diana de varios trabajos basados en esta estrategia ha sido el glicerol. Sin embargo, para disminuir un 1% (v/v) de etanol sería necesario aumentar en 17 g/L la concentración de este metabolito, lo que supondría triplicar su concentración habitual (dejando aparte la producción de metabolitos no deseados que se ha descrito habitualmente con esta estrategia). Es obvio que a esas concentraciones incluso este compuesto, relativamente abundante en los vinos de forma natural, podría tener un impacto sensorial claramente negativo. Sería aún más negativo en el caso de otras moléculas con impacto sensorial que se encuentren en el vino en concentraciones menores o incluso que no se encuentren habitualmente.

 

Levaduras y respiración

Existe un producto liberado naturalmente por las levaduras como resultado del metabolismo de los azúcares que no tendría ninguna consecuencia negativa sobre la calidad del vino, se trata del CO2. Las principales rutas metabólicas que dan lugar a la producción del CO2 son la respiración y la fermentación. A diferencia de la fermentación, en la primera no se produce alcohol, y la cantidad de CO2 producida es mucho mayor; pero es un proceso que requiere oxígeno. La figura 1 muestra las ecuaciones simplificadas de cada uno de los procesos (fig. 1).

Figura 1. Ecuación simplificada de los procesos de respiración y de fermentación de la glucosa

Nuestra propuesta para reducir el grado alcohólico consiste en permitir a la levadura respirar durante las primeras horas del proceso, proporcionándole el oxígeno necesario, de manera que al menos parte de los azúcares consumidos en ese período sean respirados en lugar de fermentados. Posteriormente, dejaría de suministrarse oxígeno, para continuar con el proceso convencional de fermentación (González et al., 2013).

S. cerevisiae es una levadura con una gran capacidad para fermentar. Esta característica es la que le da una ventaja frente a otras especies en condiciones de fermentación espontánea. Su metabolismo aeróbico se caracteriza por presentar efecto Crabtree, esto es, que a altas concentraciones de azúcares la ruta metabólica más activa será la fermentación, con independencia de la disponibilidad de oxígeno para respirar. Esta característica, compartida por algunas otras especies de levadura, hace que las especies Crabtree-positivas como S. cerevisiae no parezcan los candidatos ideales para el desarrollo de esta estrategia de reducción del grado alcohólico. Sin embargo, existen también especies de levaduras no Saccharomyces que son Crabtree-negativas. En principio, estas levaduras podrían respirar el azúcar presente en el mosto si se les proporcionase oxígeno suficiente. En la figura 2 se ilustran de manera más detallada los aspectos más relevantes del proceso propuesto.

Figura 2. Representación esquemática de la reducción del grado alcohólico (GL) entre una fermentación convencional (arriba) basada en la inoculación de solo S. cerevisiae (círculos verdes) y el método propuesto (abajo) basado en respiración de una levadura no Saccharomyces (círculos rojos). La barra verde representa la diferencia de grado entre el proceso convencional y el propuesto. Los círculos blancos en el diagrama inferior representan el aporte de oxígeno/aire

 

El desarrollo de este proceso requería encontrar respuestas a algunas cuestiones previas que nuestro grupo de investigación ha ido abordando durante los últimos años. La primera cuestión clave era si sería posible encontrar levaduras no solo Crabtree-negativas (o al menos con un efecto Crabtree mucho menos marcado que S. cerevisiae), es decir, capaces de respirar en presencia de cantidades elevadas de azúcar, puesto que este tipo de levaduras está relativamente bien identificado en la literatura científica. Sino si serían capaces de hacerlo (respirar), en un medio tan específico como el mosto de uva, que difiere enormemente de los medios utilizados previamente para identificar levaduras Crabtree-negativas. En concreto, hasta ahora se habían descrito levaduras Crabtree-negativas respirando con en presencia de 20 g/L de glucosa y a pH superiores a cinco, pero no con 200 g/L y a pH inferior a 3,5.

. «Una cuestión importante que ha surgido durante el trabajo es el impacto del oxígeno sobre la producción de ácido acético por parte de S. cerevisiae y algunas otras especies de levaduras.»
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La segunda gran cuestión era el impacto del oxígeno sobre la calidad sensorial, fundamentalmente al reaccionar con los compuestos fenólicos del vino. Resulta evidente que para permitir que las levaduras consuman el azúcar del mosto por respiración es necesario un aporte de oxígeno en las primeras fases del proceso que va bastante más allá de cualquiera de las prácticas habituales actualmente en las bodegas. Parecía conveniente encontrar condiciones de trabajo en las que todo ese aporte extraordinario de oxígeno fuese rápidamente consumido por las levaduras, de modo que el oxígeno efectivamente disuelto en el mosto en fermentación fuese prácticamente nulo.

Otras cuestiones que permanecían inicialmente en segundo plano, pero que se irán abordando durante los próximos años tienen que ver con la compatibilidad entre las cepas de levaduras que se vayan a emplear en el proceso. Y una cuestión importante que ha surgido durante el trabajo es el impacto del oxígeno sobre la producción de ácido acético por parte de S. cerevisiae y algunas otras especies de levaduras.

 

Selección de cepas

La identificación de cepas de interés para esta aplicación se llevó a cabo sobre una colección de 65 cepas pertenecientes a 28 especies diferentes de levadura, entre ellas 4 cepas de S. cerevisiae, en relación con su capacidad para respirar y llevar a cabo el proceso (Quirós et al., 2014). Para ello se determinó su cociente respiratorio (RQ=CO2 producido/O2 consumido). De acuerdo con las ecuaciones de la figura 1, los valores teóricos de RQ pueden oscilar entre 1 cuando todos los azúcares son respirados e infinito cuando todos los azúcares son fermentados. Los valores de RQ encontrados entre las cepas estudiadas oscilaron entre 1 y 4. Las cepas de S. cerevisiae estudiadas tenían un RQ entre 2 y 2,5. Un RQ de 2 implica que el 25% de los azúcares consumidos han sido respirados. Según este resultado, las cepas de S. cerevisiae también podrían utilizarse para reducir el grado alcohólico por respiración. Pero un análisis de metabolitos producidos en condiciones de aireación indicó que S. cerevisiae producía una gran cantidad de ácido acético en estas condiciones. De hecho, casi todas las levaduras pueden respirar una fracción significativa del azúcar que consumen cuando se proporciona suficiente oxígeno. Sin embargo la producción de acidez volátil, que incrementa generalmente como consecuencia de la oxigenación, puede ser muy diferente, así como la demanda de oxígeno. Por este motivo, también se incluyó la capacidad para producir acético en condiciones de aireación entre los criterios de selección.

Además del RQ, se determinó la cantidad de azúcares que las levaduras son capaces de metabolizar durante el tiempo en que se proporciona aire al sistema, con el objetivo de descartar aquellas con un metabolismo demasiado lento en estas condiciones. Con estos criterios se encontraron algunas cepas interesantes. Entre ellas, varias cepas de Metschnikowia pulcherrima.

 

Identificación de factores relevantes para la utilidad del proceso

Uno de los requisitos de este proyecto es trabajar en condiciones de aireación durante un tiempo limitado. Puesto que los requerimientos de oxígeno para conseguir una misma tasa de respiración pueden ser diferentes para cada levadura y que la presencia de oxígeno en exceso actuaría en detrimento de la calidad del vino, se consideró necesario ajustar las condiciones de oxigenación al mínimo necesario para cumplir con el objetivo propuesto.

La capacidad de las levaduras para crecer y respirar en estas condiciones depende además de otros factores, como disponibilidad de nitrógeno y temperatura. Por ello se estudió en un diseño ortogonal el efecto de estos 3 parámetros sobre 4 especies de levadura, Candida sake, Kluyveromyces lactis, M. pulcherrima, y S. cerevisiae.

.«La disponibilidad de oxígeno tiene un efecto negativo sobre el rendimiento en etanol para las 4 especies, pero la dependencia del oxígeno es muy diferente según la cepa de que se trate.»  
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Como era esperable, el rendimiento en etanol, sean cuales sean las condiciones, es mayor para S. cerevisiae que para las otras especies estudiadas. La disponibilidad de oxígeno como también era esperable, tiene un efecto negativo sobre el rendimiento en etanol para las 4 especies, pero la dependencia del oxígeno es muy diferente según la cepa de que se trate. La producción de ácido acético es mayor cuanto más oxígeno se proporciona. También la temperatura y el nitrógeno disponible tienen un impacto importante sobre el metabolismo de las levaduras y por tanto sobre la reducción del grado alcohólico o la acidez volátil. Sin embargo, el efecto es muy diferente en magnitud y sentido, dependiendo de la cepa de que se trate.

 

Prueba de concepto

Se eligió una cepa de M. pulcherrima para llevar a cabo una prueba de concepto en un experimento con mosto blanco natural (Morales et al., 2015), mediante coinoculación de esta cepa con S. cerevisiae en diferentes proporciones. Se proporcionó una mezcla de aire/nitrógeno de manera controlada al sistema durante las primeras 48 horas tras la inoculación, y luego se siguió con las condiciones de un proceso de fermentación convencional. La concentración de aire en el gas proporcionado osciló entre 0 (anaerobiosis) y 100% (solo aire). La mayor reducción de grado alcohólico respecto a la fermentación convencional se consiguió mediante la coinoculación y 100% de aire en el gas de entrada, y fue superior a 4% (v/v). Los resultados se presentan en la tabla 1.

 

Tabla 1. Concentración y rendimiento de los principales metabolitos de fermentación la final de la fermentación (262-265 g/L de azúcar consumido) de fermentaciones ventiladas con aire o nitrógeno

Fuente: Tomada de Morales et al., 2015.
Los valores son media ± desviación estándar de tres réplicas completas.
1 Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (ANOVA) para valores de la misma fila.
2 Las diferencias estadísticamente significativas (ANOVA) entre cultivos ventilados con aire o nitrógeno para el mismo parámetro se destacan con *.
YE/S: rendimiento de etanol sobre azúcar; YA/S: rendimiento de ácido acético sobre azúcar; YG/S: rendimiento de glicerol sobre azúcar.

 

En estas condiciones, el nivel de oxígeno disuelto tardaba 24 horas en bajar de 15% a 0 y la concentración de ácido acético al final del proceso estaba en el umbral de lo aceptable (0,6 g/L). Sin embargo, en condiciones de aireación inferior (25% de aire en el gas de entrada), el nivel de oxígeno disuelto se mantuvo cercano a 0 desde el inicio, se consiguió una reducción de 2% (v/v) de etanol, y los niveles de ácido acético al final del proceso fueron similares a los obtenidos con S. cerevisiae en anaerobiosis (0,3 g/L) (tabla 2).

 

Tabla 2. Concentración y rendimiento de los principales metabolitos de fermentación la final de la fermentación de fermentaciones ventiladas con mezclas de aire y nitrógeno

Fuente: Tomada de Morales et al., 2015.
Los valores son media ± desviación estándar de dos réplicas completas.
1 Letras mayúsculas diferentes indican diferencias estadísticamente significativas para valores de la misma fila (t-test).
YE/S: rendimiento de etanol sobre azúcar; YA/S: rendimiento de ácido acético sobre azúcar; YG/S: rendimiento de glicerol sobre azúcar.

 

Próximas etapas

A pesar de que estos ensayos han permitido demostrar en primera instancia la utilidad potencial del proceso propuesto, existen varios puntos sobre los que es necesario seguir trabajando para llegar a una propuesta de aplicación industrial inmediata. Esto incluye una selección de cepas de levaduras con criterios enológicos adicionales (en adición a los utilizados para la prueba de concepto). Como guía contamos con la identificación de las especies más interesantes resultado del trabajo previo. También se debe seguir optimizando el proceso y explorar las ventajas o inconvenientes de la inoculación secuencial en comparación con la simultánea que hemos ensayado inicialmente. Los requerimientos específicos de nutrientes, derivados del uso de nuevas levaduras, y la mayor producción de biomasa, sobre todo debido a la respiración, son otro tema que necesita seguir siendo analizado en el futuro. Como último ejemplo, el desarrollo industrial del proceso quizá requiera el desarrollo de prototipos para la oxigenación en volúmenes mayores. Estos podrían tener como base equipos ya en uso para procesos de micro y macrooxigenación.

 

Agradecimientos

Los autores están agradecidos a Cristina Juez Ojeda, Laura López Berges y Miguel Ángel Fernández Recio por su asistencia técnica en todo momento. El trabajo de nuestro grupo está financiado por los siguientes proyectos del MINECO, AGL2009-07327, AGL2012-32064, INIA RM2012-00007-00-00, y RTC-2014-2186-2. A.J.R. es receptora de una beca FPI del MINECO.

 

Bibliografía

González R., Quirós M., Morales P.: Yeast respiration of sugars by non-Saccharomyces yeast species: a promising and barely explored approach to lowering alcohol content of wines. Trends Food Sci Technol 2013; 29: 55-61.

Quirós M., Rojas V., González R., Morales P.: Selection of non-Saccharomyces yeast strains for reducing alcohol levels in wine by sugar respiration. Int J Food Microbiol 2014; 181: 85-91 (acceso abierto: DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.04.024).

Morales P., Rojas V., Quirós M., González R.: The impact of oxygen on the final alcohol content of wine fermented by a mixed starter culture. Appl Microbiol Biotechnol 2015; 99: 3993-4003 (acceso abierto: DOI 10.1007/s00253-014-6321-3).

 

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