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Cepas autóctonas del Priorat de Saccharomyces y no-Saccharomyces, y de bacterias lácticas, como iniciadores de vinificación: proyecto europeo Wildwine

Albert Mas, Cristina Reguant, Gemma Beltran, Braulio Esteve y Albert Bordons
Grupo de Biotecnología Enológica, Departamento de Bioquímica y Biotecnologia,
Facultad de Enología de Tarragona, Universitat Rovira i Virgili

Nuestro grupo participa en el proyecto europeo Wildwine (EU-FP7-SME-2012) conjuntamente con otros grupos de Burdeos (F), Turín (I) y Atenas (GR), así como con bodegas y asociaciones de los cuatro países participantes; en nuestro caso con la bodega Ferrer-Bobet en Porrera (Priorat, Tarragona) y el Consejo Regulador de la DOQ Priorat. Este proyecto tiene como objetivo principal aislar y seleccionar levaduras y bacterias lácticas autóctonas de diferentes regiones vitivinícolas europeas, para ser utilizadas como cultivos iniciadores de las fermentaciones alcohólica y maloláctica respectivamente.

Aunque tradicionalmente los vinos se elaboraban con los microorganismos “salvajes” (“wild”, de ahí el nombre del proyecto Wildwine), autóctonos o residentes en la uva y la bodega, actualmente en la mayoría de bodegas se utilizan cultivos comerciales iniciadores de Saccharomyces cerevisiae y de Oenococcus oeni para asegurar y controlar la vinificación. Pese a sus ventajas, con este procedimiento puede suceder que vinos de diferentes orígenes tengan una similitud sensorial. Actualmente el mercado se orienta cada vez más hacia distintas características regionales (vinos de terroir), así como hacia los vinos elaborados mediante procedimientos naturales y orgánicos. Esto plantea una oportunidad para que los países productores potencien los vinos que corresponden a terruños peculiares y que junto a antiguas tradiciones puedan producir nuevos vinos de mayor calidad con sistemas de producción “naturales”. El uso de levaduras (tanto Saccharomyces como no-Saccharomyces) y bacterias lácticas (tanto Oenococcus como otras) indígenas ofrece un gran potencial para abordar los aspectos críticos mencionados con las técnicas actuales de vinificación.

Levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces

S. cerevisiae se considera un microorganismo “domesticado” ya que es predominante en los ambientes industriales en los que se realizan las fermentaciones alcohólicas, mientras que es relativamente escaso (aunque no completamente ausente) en ambientes “naturales” o no alterados por actividades humanas. Por ello esta especie se halla presente en las bodegas de vinificación, conformando lo que se podría denominar microbiota residente en bodega. Con ello los microorganismos presentes en bodega se han reducido de forma notable, desplazados por estas levaduras seleccionadas. Por otro lado, algunas S. cerevisiae también han colonizado parte del ecosistema del viñedo, debido a prácticas habituales de las bodegas, como la incorporación de los orujos (conteniendo levaduras) al suelo del viñedo. Pese al incremento de la presencia de Saccharomyces en el viñedo, se han mantenido las tradicionales no-Saccharomyces: Hanseniaspora/Kloeckera, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula y Metschnikowia. No obstante, esto permite que alguna de las Saccharomyces que se encuentran en el viñedo puedan proliferar rápidamente después del prensado. Este empobrecimiento microbiológico se debe a una cierta recurrencia de las mismas levaduras de vinificación, ya que hay un grupo reducido de levaduras más vendidas y más utilizadas. Esto ha generado también una cierta similitud organoléptica en los vinos producidos.

Debido a la capacidad fermentativa y a su domesticación, Saccharomyces rápidamente desplaza a las otras levaduras y, por lo tanto, limita las posibles características que estas otras puedan aportar. En fermentaciones espontáneas, también se produce dicho desplazamiento, pero de forma más tardía y no siempre de manera total. No obstante, la proliferación de levaduras no-Saccharomyces supone riesgos, puesto que pueden producir defectos importantes en el vino, especialmente mal gusto u olores debidos a compuestos tales como ácido acético, acetato de etilo, fenoles volátiles, o sulfuro de hidrógeno. Por lo tanto, un aspecto interesante a profundizar es la selección de levaduras no-Saccharomyces por su posible contribución tanto de tipo organoléptico o aromático, como tecnológico.

Entre los beneficios de las levaduras no-Saccharomyces se halla la presencia de actividades pectinolíticas , de gran interés para aumentar la extracción de compuestos y fluidez de los mostos, y la actividad beta-glucosidasa, que permite la liberación de aromas a partir de sus precursores glicosilados. Estas actividades enzimáticas centraron el interés inicial por algunas levaduras no-Saccharomyces , proceso que ha llevado a la utilización comercial de algunas de ellas, como las cepas de Torulaspora delbrueckii , ya disponibles en el mercado. Otras que presentan cierto interés son algunas Hanseniaspora o Metschnikowia por su potencial aromático, o de Candida zemplinina, por su producción de glicerol y reducción de acidez, entre otras.

En estos casos se analiza su uso combinado o secuencial con levaduras Saccharomyces . La idea de esta práctica es permitir que las no-Saccharomyces (de baja tolerancia al etanol, aprox. 8% v/v) “se expresen” antes de inocular la levadura Saccharomyces que permitirá completar la fermentación alcohólica (FA). Los períodos secuenciales suelen ser de 24 a 48 horas, generalmente con el objeto de no permitir a las otras Saccharomyces, presentes en bodega o en la uva, que se acaben imponiendo y, por lo tanto, perder el control del producto final. Es decir, se está abriendo un nuevo campo de combinaciones entre no-Saccharomyces y Saccharomyces para perfeccionar el diseño de los vinos, dotándoles de unas características que puedan permitir una mejora organoléptica atractiva para el mercado.

Una alternativa añadida del uso de no-Saccharomyces es la recuperación de la huella microbiológica en el vino. Se trata de recuperar aquellas combinaciones de levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces que reflejen las combinaciones tradicionales presentes en el viñedo pero combinándolas con el control de la FA. El objetivo es elaborar un “cóctel de levaduras”, eliminando aquellas que pueden producir aspectos perjudiciales. Se busca, por un lado, mantener la huella microbiológica mediante su selección para conservar la tipicidad y, por otro, lograr el control deseado del proceso fermentativo. Además, estas combinaciones podrían ser aceptables para su uso en vinos de los denominados “orgánicos”, “ecológicos” o “naturales”, donde las reglamentaciones de muchos países aceptan el uso de levaduras seleccionadas de origen local, ya que se respetarían las características de tipicidad, sin los posibles riesgos de las fermentaciones espontáneas.

Bacterias lácticas

Al igual que la fermentación alcohólica con las levaduras, tradicionalmente la fermentación maloláctica (FML) se llevaba a cabo de forma espontánea por las bacterias lácticas (BL) autóctonas, y de hecho actualmente todavía bastantes pequeñas bodegas lo hacen de esta manera. Sin embargo, la FML espontánea es muy impredecible en cuanto a su completa realización y sobre todo en cuanto a no poder controlar los posibles aspectos negativos, como aromas no deseados o la aparición de aminas biógenas. Para superar estos obstáculos, desde hace casi 40 años se usan cultivos iniciadores comerciales de cepas seleccionadas, sobre todo de Oenococcus oeni, gracias a su resistencia al etanol y pH del vino.

A pesar de los claros beneficios de los cultivos iniciadores para la FML, el número de cepas de O. oeni que se utilizan con éxito es muy limitado, y hay una demanda creciente de nuevos cultivos que lleven a cabo un rápido desarrollo de la FML en las difíciles y diversas condiciones del vino, que tengan buenas propiedades organolépticas, y que satisfagan las condiciones de seguridad alimentaria en cuanto a no producción de aminas.

Además de O. oeni, otras especies de BL también pueden presentar una buena capacidad de realizarla FML. Entre ellas, las cepas de Lactobacillus plantarum presentan los resultados más prometedores en condiciones de pH alto, con una baja producción de ácido acético y un perfil enzimático más complejo. Cuando se compara con O. oeni, Lactobacillus produce más enzimas, tales como glicosidasas , proteasas, esterasas y otras, que mejoran el perfil aromático del vino. Las cepas de lactobacilos también producen ciertas bacteriocinas, que les proporcionan una ventaja competitiva sobre otras bacterias perjudiciales. Todo ello hace que algunas cepas de Lactobacillus puedan llegar a ser cultivos iniciadores en el futuro.

La selección de cepas wild indígenas, de BL, sean de O. oeni u otras especies, competentes para su uso como cultivos iniciadores, puede lograr que la FML se lleve a cabo de manera controlada y reproducible , y así evitar aminas biógenas y mejorar las cualidades sensoriales del vino. Al mismo tiempo, y tal como comentábamos con las levaduras, con el uso de bacterias autóctonas de cada zona se potencian las características peculiares del terroir y se recupera la biodiversidad del ecosistema vitivinícola.

Obtención y selección de cepas de Saccharomyces y no-Saccharomyces autóctonas del Priorat

Durante las vendimias de 2012 y 2013 se recogieron muestras tanto de uvas como durante las fermentaciones alcohólicas realizadas en condiciones estériles en laboratorio o en bodegas comerciales. Se recogieron más de 2000 colonias que se identificaron y tipificaron. En base a los perfiles moleculares, con un cierto interés enológico, se encontraron 13 cepas de Saccharomyces cerevisiae, 18 de Hansiaspora uvarum, 11 de Candida zemplinina, 3 de Metschnikowia pulcherrima y 1 de Torulaspora delbrueckii. Diferentes combinaciones de estas cepas se van a probar en esta vendimia en la bodega de Ferret-Bobet.

Obtención y selección de cepas de bacterias lácticas autóctonas del Priorat

En las mismas vendimias y vinificaciones de 2012 y 2013 se tomaron muestras de uvas y de vinos de distintas fincas y bodegas del Priorat, y a partir de ellas se obtuvieron unos 1900 aislados de BL. Aplicando técnicas moleculares, se identificaron unos 1400 aislados de Oenococcus oeni que correspondían a unas 90 cepas distintas y que se habían aislado sobre todo de FML espontáneas, pero algunas también directamente de las uvas. El resto de aislados, sobre todo procedentes de uvas, se identificaron como diversas especies de Lactobacillus, destacando 10 cepas de L. plantarum.

Las cepas predominantes (unas 40) se han sometido a pruebas de selección en vino simulado (12% y 14% etanol) en el laboratorio para ver el consumo de L-málico. Con las mismas cepas también se han realizado tests de crecimiento en vino simulado a diferentes pH (de 2,8 a 4) y de etanol (de 12 a 16%).

Con estos resultados se han seleccionado tres cepas de O. oeni más resistentes y eficaces en cuanto a la FML, que son las utilizadas en las pruebas de vinificación del proceso Wildwine.

Proceso Wildwine de vinificación con cepas autóctonas seleccionadas

Las cepas seleccionadas mencionadas (Saccharomyces, no-Saccharomyces y Oenococcus oeni), autóctonas del Priorat, serán utilizadas en la vinificación real de esta vendimia, tanto para garnacha como para cariñena, en la bodega Ferrer-Bobet, siguiendo el planteamiento comentado del proceso Wildwine, que se esquematiza en la figura 1. En primer lugar se inocularán las levaduras no-Saccharomyces seleccionadas, al inicio de la fermentación. A las 24 horas se inocularán las levaduras Saccharomyces, para que al final de la FA se inoculen las bacterias lácticas seleccionadas.

 

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Figura 1: Esquema de la evolución de poblaciones microbianas en el proceso Wildwine desde el mosto (izquierda) a la fermentación alcohólica (centro) y la maloláctica (derecha). Códigos: (SC) Saccharomyces cerevisiae son las figuras de levaduras en gemación (color rojo), que pueden ser diferentes cepas (distinta orientación). Las levaduras no-Saccharomyces (Non-S) son los diferentes poliedros y su color representa la aportación positiva (verde) o negativa (azul) a la calidad del vino. Las bacterias acéticas (AAB) son los circulitos estrellados y las lácticas (LAB) los circulitos de diferentes colores. Véase explicación en el texto. (En el gráfico, AAB: bacterias acéticas y LAB: bacterias lácticas.)


Previamente en el laboratorio se ha procedido a generar suficiente biomasa de cada cepa, creciéndolas en medio rico para tener un número de células adecuado en la inoculación del vino. Una vez crecidas, son recogidas (fig. 2), centrifugadas y lavadas y se procede a la inoculación en el mosto, o en el vino al final de la FA en el caso de las BL.

 

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Figura 2: Recogida de células de microorganismos seleccionados para el proceso Wildwine, crecidas en medio rico para proceder a su concentración e inoculación en el mosto.

 

Una vez finalizada la vinificación, se procederá a la caracterización química y sensorial de los vinos producidos.

 

[29.09.14]