La levadura del vino: de la domesticación inconsciente a la evolución dirigida en el laboratorio

La conferencia planteó un recorrido por la evolución de la levadura, en la que el hombre intervino, al principio sin ser consciente de ello y hoy en día lo sigue haciendo con nuevas herramientas.

Nos indica que había preparado una primera parte sobre el microbioma de la uva pero considera que los anteriores ponentes ya lo han tratado ampliamente, por lo que no insistirá demasiado en ello. Posteriormente hablará de la adaptación de la levadura a este ambiente creado por el hombre, con sus procesos fermentativos de todo tipo y cómo quedan marcas claras, lo que se llaman firmas de domesticación en el genoma de la levadura. Finalmente pasará a cómo, de esa diversidad natural que tenemos y que estamos explotando, se puede ampliar mediante diferentes técnicas de mejora genética. También explicará algún ejemplo de lo que han hecho de evolución adaptativa en su laboratorio.

«Ya se ha demostrado que la elaboración de vino es un proceso muy diverso, donde crecen numerosos microorganismos, principalmente las levaduras (las más protagonistas en la parte fermentativa), pero ya hemos visto cómo desde la uva están creciendo, desarrollándose, produciendo metabolitos que luego son transformados por otros, etc. Y esta diversidad de levaduras (se han descrito hasta 93 especies diferentes) están creando una huella metabólica. Todos sabemos que esta es la ruta prioritaria durante la fermentación alcohólica, pero luego hay toda una serie de metabolitos secundarios, que se producen durante la fermentación alcohólica, que son los que están determinando la calidad del vino: alcoholes superiores, ésteres aldehídos, etc. Por tanto, aquí existe una analogía entre lo que es el microbioma humano y lo que es el microbioma de la uva.

El proceso viene muy condicionado por todo el microbioma, desde la planta hasta que el vino es embotellado, y, por supuesto, reivindicar el terroir microbiano. Aunque a mí siempre me ha dado la sensación de que en el mundo de la enología se consideraba que la única parte importante era la de viticultura de la planta y que con tener una buena uva todo estaba hecho. Evidentemente, si no tienes una buena uva…, pero intentar fermentar el mismo mosto que proviene de la misma uva con dos levaduras diferentes, a ver si se obtiene el mismo vino.»

«A continuación, me voy a centrar en la reina de la fermentación, que es Saccharomyces cerevisiae porque, dentro de ese proceso de evolución, ha sido la que mejor se ha adaptado, es la más competente, la que tiene la capacidad de captar azúcares transformarlos en etanol y consumir nutrientes. Eso llevó, en el año 1993, a Martini, a decir que había que considerar las levaduras Saccharomyces cerevisiae como el primer organismo domesticado por los humanos. No solo es importante desde el punto de vista industrial en procesos fermentativos múltiples, sino que, se denomina organismo modelo.»

«Cuando se estudió la evolución de Saccharomyces cerevisiae, con diferentes marcadores moleculares, como en este trabajo del grupo de Gianni Litti hace bastantes años, por primera vez se hizo una filogenia a partir del genoma completo de 70 cepas de levadura. Se empezaba a desarrollar la secuenciación masiva de genomas y se llegaba a la conclusión de que este agrupamiento filogenético siempre venía marcado. Uno, por el nicho del que había sido aislado y otro, por el lugar geográfico en el que había sido aislado. Es decir, nicho ecológico más terroir era lo que marcaba la similitud entre las cepas. Estas levaduras vínicas formaban un agrupamiento bastante homogéneo, muy diferentes de otras levaduras.

Los distintos agrupamientos que se producían entre los distintos nichos venían marcados porque las levaduras vínicas tienen una serie de características de interés enológico, que son consecuencia de cambios claros en el genoma de la levadura. Estos cambios pueden ser desde una variante alélica, es decir, alelos que solo están en las levaduras vínicas. Las levaduras vínicas tienen una versión truncada que es diferente de cualquier levadura que aíslas del ambiente y perteneciente a la misma especie. También son más resistentes al cobre que cualquier otra levadura, puesto que el principal tratamiento que se ha estado haciendo en la historia de la viticultura es el sulfato de cobre, y ello ha hecho que las levaduras se hagan resistentes a ese cobre.

La estrategia ha sido aumentando el número de copias del gen CUP-1, que es el que le da resistencia al cobre (así, las levaduras vínicas tienen siete, ocho, diez copias de este CUP-1, cuando una levadura aislada de la naturaleza solo tiene una), o estos genes (son transportadores de fructosa o de oligopéptidos) que son una región que viene de una transferencia horizontal a partir de otra levadura, que también está en el ambiente fermentativo como es Torulospora. Existen pues estos fenómenos de transferencia horizontal, es decir, DNA que se transfiere de una levadura a la otra.

Finalmente, vemos la tolerancia de las levaduras del vino al sulfito debido a ese proceso de selección, por parte del hombre, que utiliza el sulfito como un antimicrobiano. El mecanismo de tolerancia al sulfito se debe a que hay una bomba excretora de sulfito en la membrana, que está codificada por el gen SS1P, y aquellas levaduras que son más capaces de excretar el sulfito (o el bisulfito) al exterior son las que tienen mayor tolerancia.

En el 2002, un grupo de investigadores (Amparo Querol junto con otros investigadores de la Facultad de Valencia) describieron el primer mecanismo que hacía las levaduras vínicas más resistentes al sulfito, y ello era debido a que esta bomba de sulfito está codificada en el cromosoma 16 y se producía una traslocación del cromosoma 16 al 8. Cuando esa secuencia, ese gen, se traslocaba de un cromosoma a otro, lo que hacía era cambiar la zona reguladora de ese gen, que llamamos promotor. Y ese promotor era mucho más activo en la nueva zona y provocaba que hubiera una mayor actividad transcripcional y, por tanto, una mayor capacidad de excretar este sulfito desde el interior de la célula.»

«Es importante saber que, a pesar de la homogeneidad filogenética que veíamos y ese parecido entre las levaduras del vino, existe una gran diversidad natural que hemos explotado y debemos explotar en el futuro. Pero mucha de esta diversidad natural ha sido seleccionada en base a unas características que hoy no nos son útiles o que representan un problema.

¿Cómo generamos nueva diversidad de levaduras? Mediante distintas técnicas de mejora genética o de aumento de diversidad. Realizamos técnicas clásicas, como la mutagénesis o la hibridación tanto intra- como interespecífica, entre cepas de la misma especie o incluso entre especies más o menos próximas, y que haya cierta compatibilidad genómica. También realizamos métodos de ingeniería evolutiva o evolución adaptativa de laboratorio, que es en la que me centraré a continuación. Una ventaja de estos mecanismos es que no son cepas consideradas como un organismo modificado genéticamente (GMO).»

Evolución adaptativa del laboratorio

Se trata de lo que ha hecho el hombre de manera inconsciente, pero hacerlo de una manera consciente, dirigida en el laboratorio y en menos tiempo. Es decir, tener un cultivo continuamente reproduciéndose. Por simple crecimiento de ese cultivo se generan mutaciones, porque las polimerasas que replican el DNA no son 100% eficientes y cometen errores, cometen mutaciones, y mediante tu presión selectiva vas seleccionando aquellas mutaciones que van en tu favor.

«En resumen, partes de una cepa que tiene una determinada eficacia y llegas a una cepa con una mayor eficacia según la presión selectiva que le estás poniendo. Además, con este tipo de trabajo puedes conseguir la secuencia completa del genoma y, comparando la de la levadura inicial y la del punto final, puedes saber qué cambios se han producido en el genoma y cuáles son los responsables de ese nuevo fenotipo que tienes en tu cepa. Si, por ejemplo, se realiza un crecimiento en fermentación a baja temperatura (criotolerancia), ves qué genes están implicados.

Como en todo, existen pros y contras. Una ventaja de esta técnica es que no necesitas conocer demasiado el genoma de la levadura que tienes y que quieres mejorar. Se pueden conseguir mejoras en características cuantitativas y complejas desde el punto de vista genético. En cuanto a contras, podemos mencionar que, a veces se necesita mucho tiempo. Hicimos un proyecto de mejora a criotolerancia cuyo experimento duró nueve meses. También existe el riesgo de lo que se conoce como “mecanismos de compensación”, es decir, están mejorando una característica de interés industrial, pero lo está haciendo a costa de perjudicarse otra.»

Debe diseñarse muy bien el experimento de evolución adaptativa porque puede pasar que quieras mejorarla frente a un determinado estrés y no te des cuenta de que con tus diseños la estás adaptando para otro completamente diferente. De ahí la importancia de hacer un buen diseño.

Disponemos de una herramienta poderosísima, que es la posibilidad de editar el genoma (editar es como cortar, pegar, borrar, reescribir). Una herramienta fundamentalmente basada nucleasas programables denominada CRISPR. La más conocida es la Cas9, y el método CRISPR-Cas9, que puede dirigirse a una zona concreta del genoma, cortar y pegar lo que se quiera, modificar, hacer un cambio de nucleótido, etc.

Con el fin de explicar los trabajos que están realizando sobre evolución adaptativa, José Manuel Guillamón expuso las publicaciones realizadas en las que buscaban adaptar levaduras para que fermentasen a bajas temperaturas, o mediante evolución adaptativa conseguir todo lo contrario, una levadura que fuese capaz de fermentar a 40 ºC, pero remarcó un trabajo que están realizando sobre el metabolismo del nitrógeno.

«Trabajamos en el metabolismo del nitrógeno y hemos caracterizado los aminoácidos que producían o que mejoraban el crecimiento de las levaduras, pero en un trabajo del 2020 vimos las preferencias de las levaduras por la captación de los distintos aminoácidos, indicando el orden en que era captado el aminoácido durante la fermentación alcohólica. Lo que nos llamó la atención es que el aminoácido consumido primero era la lisina por encima de otros muchos que estaban en cantidades mucho más pequeñas. Y porque la lisina, en el caso de Saccharomyces cerevisiae, no la puede utilizar como fuente de nitrógeno, la puede incorporar directamente a las proteínas, pero no puede catabolizar a partir de la lisina y generar otros aminoácidos. Pero por esa fecha, el grupo de Markus Ralser del Imperial College de Londres, publicó en la revista Nature que la captación de lisina para Saccharomyces cerevisiae era una estrategia para luchar frente al estrés oxidativo. Ello nos ayudó a ver que no es que le está dando una ventaja como fuente de nitrógeno la lisina, sino que le está permitiendo enfrentarse mejor a lo que es el estrés oxidativo durante la fermentación alcohólica. Con estos argumentos pensamos que podía ser un proyecto interesante para la empresa Lallemand que nos financió el proyecto.»

«Hicimos un proceso de evolución adaptativa en presencia de aminoetilcisteína (AEC) (análogo de la lisina), para explicar cuál era el razonamiento de que los mutantes a esta droga aumentaran la lisina. Y era que la toxicidad venía porque la célula lo confunde, como si fuera lisina, lo introduce y lo incorpora a las proteínas. Y cuando lo hace éstas ya no funcionan. Solo aquellas cepas que eran capaces de producir mucha lisina intracelular diluían el efecto de la droga. Bueno, pues realizamos el experimento de evolución adaptativa en presencia de concentraciones crecientes de AEC, empezamos con una cantidad muy baja de AEC que ya afectaba el crecimiento de la levadura vínica 71B y llegamos hasta concentraciones de 10 milimolar. A 10 milimolar las cepas, después de la evolución, podían crecer perfectamente.

Seleccionábamos colonias que eran resistentes a este AEC y cuando nos íbamos a testar su concentración de lisina, teníamos colonias de distintas concentraciones: aquí está la parental, la 71B, y teníamos dos que, en este caso, acumulaban una gran cantidad de lisina. Pues estas son las nuestras. Vamos a seguir trabajando, sobre todo con la 7, que es la que más acumula.»

«Realizamos una cinética de acumulación de lisina y vimos que la cepa evolucionada 7 acumulaba mucha lisina, pero solo al inicio del crecimiento. En cuanto entraba en fase estacionaria, esa lisina empezaba a liberarla, que aumentaba en el medio. Nosotros queríamos que la retuviese dentro, pero, por otra parte, teníamos una levadura que estaba cogiendo amonio (porque esto se hacía en un medio donde solo había amonio como fuente de nitrógeno), que es una fuente de nitrógeno muy barata, y nos la estaba convirtiendo en lisina, o sea, que podía tener su interés. Además, cuando estudiábamos la concentración de aminoácidos intracelulares, esta cepa acumulaba más del doble que la cepa parental de la que venía, la 71B. Y además, como el grupo de Ralser había hablado de la relación que podía haber entre la lisina y el glutatión, mirábamos el glutatión intracelular y la cepa evolucionada tenía unas concentraciones significativamente mayores que la cepa control (la cepa parental) especialmente del glutatión reducido, que es el que más interesa.

Por tanto, teníamos una cepa que acumulaba lisina, pero que, además, acumulaba más aminoácidos y glutatión. Eso se lo pasamos a Lallemand y están haciendo sus pruebas para ver si realmente representa una mejora respecto a los productos que tienen habitualmente.»

«Nosotros queríamos averiguar qué justificaba que esta levadura sea capaz de acumular más lisina. Para eso comparábamos la secuencia de las levaduras evolucionadas frente a su parental y la primera sorpresa que nos llevamos fue que había una gran cantidad de cambios en el genoma, cambios no solo de los SNP (polimorfismos de nucleótidos únicos), sino también reordenaciones, distinto tipo de cosas, y la mayoría de esos cambios eran comunes entre las dos cepas, es decir que había sido un proceso en paralelo. Parece que esas mutaciones eran comunes a las dos cepas. Esto ponía de manifiesto que el mutágeno tenía un alto poder, pero lo que nos interesaba era ver las mutaciones que se producían en la ruta de síntesis de la lisina.

Vimos distintos genes, LYS1, LYS2, una serie de genes en los que encontrábamos mutaciones, cambios nucleotídicos que implicaban un cambio de aminoácido en la proteína. Con esa técnica CRISPR, validamos todos estos cambios en la cepa parental, en la 71B, y vimos qué efecto tenía. Nuestra forma de distinguirlo era ver si el cambio tenía un efecto o no en la acumulación de lisina, mirando si era capaz de crecer en presencia de AEC, de ese tóxico…»

«Hace unos años empezamos a trabajar en la síntesis de moléculas derivadas de los aminoácidos aromáticos, especialmente del triptófano y de la tirosina que se hallan en el vino. Son moléculas bioactivas que se supone que tienen un beneficio para el consumidor. Demostramos que eran las levaduras las que producían esos metabolitos. Y uno de los objetivos que nos planteamos en este proyecto fue qué papel fisiológico tenían esos metabolitos.

Realizamos un trabajo en el que enriquecíamos las células en melatonina, lavábamos para eliminar la melatonina del medio y hacíamos un tratamiento con ultravioleta y un tratamiento con peróxido de hidrógeno para generar un estrés oxidativo fuerte. Posteriormente veíamos el efecto que tenía la melatonina en el crecimiento y en la viabilidad.»

El conferenciante muestra el trabajo con ultravioleta porque parece el más evidente. En el que se tienen cepas, o sea, las células no tratadas con melatonina y tratadas con melatonina. Sin ultravioleta, los recuentos son similares, el tener melatonina no influía en el crecimiento de la levadura, pero cuando no había melatonina intracelular y se aplicaba ultravioleta como un estrés, había grandes diferencias. La melatonina sí que tenía un papel claramente protector.

«¿Cómo podemos obtener una levadura vínica que produzca más de estos compuestos?, porque los produce en cantidades muy pequeñas (PPB).

Se nos ocurrió un diseño experimental, de nuevo con un proceso de evolución adaptativa, con dos fermentadores creciendo en paralelo, uno de ellos sin luz y otro estresado por luz blanca. Aquí podéis ver un poco el efecto de la radiación, desde niveles muy bajos.

Finalizado el experimento veíamos que, siempre que se cultivaban las células que habían evolucionado frente a la luz, producían un color amarillo en el medio. Aquí las veías todas agregadas, como formando pseudofilamentos. Y, cuando se centrifugaban, la levadura evolucionada efectivamente tenía un color naranja, es decir, parecía que se estaba protegiendo frente a la luz produciendo algún pigmento.

La luz blanca estaba siendo un mutágeno muy potente. Pero, nuestro objetivo era comprobar si esta levadura, después de la evolución, era capaz de producir más estos metabolitos. Y para ello, gracias a la empresa Leitat, hicimos un análisis metabolómico no dirigido y otro análisis metabólico dirigido, con un número concreto de metabolitos. Y comparábamos la cepa control, la que había evolucionado también, pero sin luz, la que había evolucionado con la luz y la evolucionada en presencia de luz. Es decir, en oscuridad y en luz.»

«El resultado nos sorprendió gratamente, pues el que tenía más enriquecimiento y más significativo, era el metabolismo del triptófano y del glutatión.

También se hizo un análisis dirigido de 34 metabolitos derivados del triptófano que, desde el punto de vista biomédico, son muy importantes. La tabla muestra el número de veces que aumentaba sobre la cepa parental. Así, pues, la levadura había producido un compuesto, un precursor, que probablemente es el responsable de esa protección frente a la luz y ese color que veíamos en las células.

Como teníamos datos no solo metabólicos, sino genómicos y de transcripción, hicimos una especie de conciliación de los distintos datos y lo que vimos fueron genes que habían sufrido cambios en su secuencia codificante y, además, que aumentaba su transcripción. O sea, que estaba justificada la síntesis, mayor síntesis de estas moléculas por un cambio genómico que se habían producido en genes claves de la ruta de síntesis.»

Conclusiones

– Las levaduras del vino comparten una historia evolutiva común y tienen una estructura de población muy sólida, con diferentes eventos de domesticación.

– La diversidad natural de las levaduras puede ser explotada y es muy importante establecer cuáles son los determinantes moleculares de las distintas características de interés industrial.

– La diversidad natural puede ser aumentada utilizando distintas técnicas genéticas.

– La técnica de evolución adaptativa es un método muy simple y efectivo para obtener cepas mejoradas que resistan la mayoría de los estreses a los que se enfrenta durante la fermentación del vino.

Sería muy deseable una regulación más flexible sobre las técnicas de edición genética, que pueden mejorar los efectos negativos que está produciendo el cambio climático.

Finalmente, agradecer a los miembros del grupo y a los colaboradores industriales, tanto a Lallemand como Codorníu y Dominio de la Vega, pues nos han ayudado financieramente en los proyectos.

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