Bacterias al límite: situaciones de estrés como entrenadores evolutivos

Sergi Ferrer desarrolló la conferencia bajo el título «Bacterias al límite: situaciones de estrés como entrenadores evoluticos». Aunque, nos indica, que también podría haberla denominado «Las bacterias también tienen su corazoncito».

«Con este título indicamos que vamos a poner esas bacterias al límite, no solamente las vamos a utilizar, sino que vamos a apretarles un poquito más las tuercas. Hay que recordar que estamos en un ambiente industrial y que lo que queremos es apretar los microorganismos, haciéndoles que produzcan todo aquello que queremos producir.»

Como ya puso de manifiesto José Manuel Guillamón en su ponencia en este mismo congreso, antiguamente, las levaduras se seleccionaban por su capacidad de producir etanol. Sin embargo, ahora, se busca reducirlo, pero hay más, también se busca reducir el sulfito y, paralelamente se añaden otras sustancias que pueden tener efectos negativos sobre los microorganismos presentes, ya de por sí estresados por el ambiente que, a medida que va avanzando el proceso de fermentación, los estresa todavía más. Existe, pues, un proceso de estrés y de selección, pero lejos de conformarnos, queremos presionarlos todavía más, a pesar de que por sí mismos ya se autoseleccionan.

Hay que recordar que desde el 2020 ha cambiado la nomenclatura de los Lactobacillus. La mayoría de ellos actualmente se llaman de otra manera; algunos mantienen el nombre, pero, por ejemplo, Lactobacillus plantarum hoy es Lactiplantibacillus plantarum. Se puede seguir utilizando el nombre antiguo, pero es recomendable actualizarse. Así, en el 95 se pasó de Leuconostoc oenus a Oenococcus oeni, y casi nadie recuerda el primero.

A pesar de la autoselección a que tiende el proceso en el caso de bacterias, no significa que de forma espontánea no puedan existir, e incluso muchas veces llegan a provocar alteraciones en el vino. Así que es necesario modificar esta situación.

«Antiguamente, cuando se encabezaba con 15 grados alcohólicos, estábamos hasta 200 de sulfuroso, etc., me acuerdo de la primera vez que me dijeron, ‘en Argentina han llegado a pH 4’, no sabía si creerlo. Ahora, muchos lo firmaríamos. También muchos organismos alterantes pueden crecer más fácilmente a valores de pH más elevado, y estamos reduciendo sulfuroso y esta es la tendencia.»

Las bacterias lácticas realizan su función mayoritariamente en la fermentación maloláctica. Pero no solo en ese proceso. Hay ventajas e inconvenientes en la coinoculación con las levaduras o hacer la inoculación posfermentación alcohólica. Hay que observar los cambios metabólicos que van a sufrir, así como el por qué.

También hay diferencias muy grandes inoculando las bacterias, no solamente las levaduras en mosto, o cuando se inoculan en el vino. Se trata de diferencias en nutrientes, en factores negativos, aporte de etanol, etc., el propio sulfuroso que pueden producir las levaduras, y esto hace que tengamos una afectación importante de todos estos factores que, además, operan conjuntamente. Si, por ejemplo, los contenidos alcohólicos son más elevados, puede haber más dificultad para realizar la maloláctica. “En algunos casos se solicitan bacterias que puedan realizar la maloláctica en un ambiente con 16 grados alcohólicos, y eso es estar pidiendo mucho.”

«Los criterios de selección que nosotros aplicamos para cultivos malolácticos son: elevada supervivencia, crecimiento rápido, incapacidad de producir ácido acético, etc., no tener aspectos negativos y no producir aminas biógenas. También incluimos como criterio, que sean capaces de degradar, porque hace tiempo vimos que muchas cepas que teníamos no solamente no producían aminas, sino que podían degradar aminas biógenas, incluso ocratoxina, fenoles volátiles, y esto lo aprovechamos a favor.»

Las interacciones con microorganismos, positivos y negativos, corresponde al tema de la bioprotección, y es algo que también estudia el grupo del ponente, principalmente con la posibilidad de disponer de microorganismos capaces de tener sinergias o antagonismos. Las bacterias también tienen sus metabolitos, no solamente los de la fermentación maloláctica, sino, igual que las levaduras, producen muchos otros metabolitos. Y hay procesos de estrés que, lógicamente, van a modular todo lo que se está produciendo. No solamente pueden producir láctico o acético, sino también un poco de etanol, de acetilo, acetoína, etc.

Las dos especies más importantes que se utilizan mayoritariamente para inocular en vino son Oenococcus oeni y Lactiplantibacillus plantarum.

Oenococcus oeni es una bacteria perfectamente conocida. Tolera pH relativamente bajos y presenta una tolerancia bastante elevada frente a etanol a niveles relativamente altos de sulfuroso. Realmente no incrementa apenas la volátil (“si hay un aumento de volátil por inoculación con Oenococcus oeni seguramente hay algo que no se hecho correctamente”). Sí tiene potencialidad de producir ácido acético, pero no necesariamente lo producirá. Incrementa ligeramente el perfil aromático, pero hay otros organismos como L. plantarum que lo hacen, aunque tienen peores supervivencias, resisten peor el pH, el etanol o el sulfuroso. Así, pues, se trata de mejorar estos lactobacillus para que puedan mantener estas características, llevándolos al extremo.

Es cierto que pueden acidificar cuando crecen, esto es importante. Puede producirse una maloláctica con un lactobacillus después de la fermentación alcohólica, pero si no hay azúcar disponible no va a haber producción de ácido. Sí habrá láctico de la maloláctica, pero no habrá una generación neta de ácidos. Los lactobacillus pueden acidificar, aunque sea parcialmente, pero es importantísimo que sea cuando crecen. Y van a crecer si tienen carbohidratos al principio.

La capacidad de crecimiento de ambas especies no es la misma, pero en cualquier caso los lactobacillus solamente crecerán si tienen azúcares, que son los que les dan energía para ello. Entonces, lo que debemos hacer es que estos lactobacillus, que son menos resistentes en estas condiciones, lo sean.

En el caso de vinos de cava, de un carácter relativamente ácido, trabajar con lactobacillus requiere adaptarlos. Sobre todo frente a pH y sulfuroso.

El esquema de trabajo es un poco similar al ya expuesto en la anterior ponencia de José Manuel Guillamón: ir progresivamente adaptando (estresando) estos microorganismos, primero a pH y luego a sulfuroso, en este orden, ya que, por ejemplo, a pH 5 el sulfuroso no hace absolutamente nada.

«Cuando nosotros teníamos un organismo en un determinado nivel, lo que hacíamos era sembrar en ese nivel, y un poco más bajo, pero muchas veces en el mismo nivel una segunda o una tercera reinoculación hacía que funcionara mejor. Es decir, la primera vez que lo ponemos, a lo mejor a 3,8 crece muy poquito, pero resembrado de 3,8 en 3,8 dos o tres veces crece mucho mejor. También en cada paso introdujimos procesos de estrés, generamos estrés a estas bacterias para irlas preparando para esta adaptación. Fijaros que estamos partiendo de niveles de pH muy altos, y los Lactobacillus su pH óptimo es 6 o 6,5, y no nos pongamos en el caso de 3, por ejemplo, que llegamos a hacer. Llegamos a pH de 3 para luego inocular en vino en 3,2. Si apretamos un poco más, cuando luego subimos un poco el pH, van más relajadas. Si hacemos que se adapten a 3,2 estarán adaptadas a ese pH como mucho, pero si forzamos un poco más y hacemos que se adapten a 3, les facilitamos la vida y “nos dan las gracias” cuando pasamos a pH un poco más elevado.

Como estrategia, en los procesos de selección, a veces nos pasamos un poco de pH para luego tenerlo más fácil. Recordad que primero adaptamos a pH y luego una vez las células adaptadas a pH, a sulfuroso. En este caso, llegamos a 3 gramos por hectolitro de sulfuroso.»

La representación de varias cinéticas de crecimiento de algunas de estas cepas (en las diapositivas) se observa que al dirminuir los niveles de pH, las células tardan más en crecer (van más lentas y crecen menos), pero todavía pueden crecer. Hay supervivencia durante mucho tiempo a pH de 2,9. Estos experimentos se han realizado a escala de laboratorio, porque cuando se pasa a producción industrial se convierte en un problema de rendimiento.

En cuanto a pH, científicamente hablando, si un organismo que es capaz de crecer a unos pH óptimos de 6 a 3,8-3,5 podrá adaptarse a muchos vinos, ya que son valores habituales.

Con el sulfuroso ocurre algo similar. Fases de latencia un poco más largas, crecimiento un poco más lento, etc. Algunas cepas no lo resistirán, pero muchas sí son capaces de crecer en estas condiciones.

¿Qué ocurre con la fermentación maloláctica? En todos los casos se está produciendo en menos de una semana.”

Respecto del málico, el ponente muestra un ejemplo de un macabeo con 2 gramos de málico por litro. Y luego unas producciones de láctico que en algunos casos pueden ser iguales o superiores a los 6. Esto se produce porque parte de ese láctico proviene de los azúcares. Y señala que se está consumiendo totalmente el málico y que conforme se incrementa el estrés, hay más diversidad de respuestas.

En cuanto a la bajada del pH,  puede estar bajando en algunos casos, incluso con la maloláctica hecha. Con unos niveles de pH bajos y con sulfurosos relativamente altos, se puede no solo compensar el incremento de pH por el aumento de la maloláctica, sino también consiguiendo unos pH finales más bajos del inicial, gracias a todo el ácido láctico que se está produciendo. La potencialidad puede llegar a producir incluso 5 gramos por hectólitro

En cuanto a la composición sensorial, se realizaron catas con estas bacterias en el vino control y en distintos vinos, y se comprobó que tenía aspectos más afrutados, más florales, menos defectos, mayor untuosidad, etc.

Aparte de etanol, ácidos, sulfuros, etc., existen otros sistemas de estrés y de resistencia a distintos factores, como por ejemplo al cobre. El esquema es el mismo, ir realizando presión y estrés selectivo y luego en las placas de gradiente ver si se ha conseguido o no el tener una resistencia mayor. Una cosa significativa puede verse en la ampliación de la zona de transferencia de crecimiento o no crecimiento, cuando deja de crecer, lo hace muy rápidamente. Esto significa que un poco más de cobre del que tolera muy bien, la mata. Es decir, que no hay una gradación más o menos progresiva. Hay un umbral abrupto entre crecer estupendamente y no crecer.

Y, por último, en cuanto a la resistencia al cobre, hay que tener en cuenta posibles situaciones límite. El ponente muestra una imagen de una situación totalmente anómala. Se trata de un producto fitosanitario con base a cobre.

«Dentro del bote del producto técnico, se observa un hongo que está creciendo. Ese producto está concentrado 500 o 1000 veces respecto de su uso como antifúngico en base al cobre. Es decir, que este organismo es capaz de crecer en un producto que tiene 500 o 1000 veces más.»

Es, por tanto, prioritario evitar propagar microorganismos resistentes a los antifúngicos habituales.