Métodos de tipado molecular para la identificación de diferentes especies de levaduras enológicas

Principales métodos de tipado molecular

PCR-RFLP (Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción)

En el análisis molecular de levaduras, dos regiones ribosomales se emplean comúnmente para su identificación: el dominio D1/D2 de la subunidad grande del ribosoma (LSU, por sus siglas en inglés), especialmente útil para especies ascomicetas (Kurtzman & Robnett, 2014), y la región que abarca los espaciadores transcritos internos junto con el gen ribosomal 5.8S (ITS1-5.8S-ITS2), que permite identificar tanto ascomicetas como basidiomicetas. De hecho, la región ITS ha sido propuesta como un “código de barras molecular” para hongos y es ampliamente aceptada para la identificación taxonómica de levaduras  (Schoch et al., 2012).

Los genes ribosómicos 18S, 5.8S y 26S se disponen en tándem formando unidades de transcripción, dentro de las cuales se encuentran dos regiones conocidas como ITS1 e ITS2, que flanquean el gen 5.8S. Estas regiones, denominadas “espaciadores internos transcritos” (ITS, por sus siglas en inglés internal transcribed spacers), aunque se transcriben, no forman parte del RNA funcional. Su alta variabilidad genética ha hecho que sean ampliamente utilizadas como marcadores moleculares para diferenciar géneros y especies de levaduras (White et al. 1990).

La técnica comúnmente utilizada para analizar estas regiones es la PCR de los ITS y su posterior RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción tras amplificación por PCR). El procedimiento comienza con la amplificación de la región ITS mediante los cebadores ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) e ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’). Posteriormente, el producto amplificado se digiere con enzimas de restricción, como CfoI, HaeIII, HinfI, DdeI o MboI. La digestión genera fragmentos de diferentes tamaños que se separan por electroforesis en gel, produciendo un patrón de bandas característico de cada especie (Esteve-Zarzoso et al., 1999; Guillamón et al., 1998).

Estos patrones pueden compararse con bases de datos como GenBank para lograr la identificación precisa de las levaduras analizadas. Una de las principales ventajas de este método es que permite trabajar directamente con cultivos celulares, sin necesidad de purificar previamente el DNA. Debido a su eficacia y simplicidad, esta técnica está recomendada por la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV) para la identificación de levaduras a nivel específico.

Entre las metodologías basadas en PCR disponibles, la secuenciación por tecnología Sanger de la región LSU ha demostrado ser la más confiable para la identificación a nivel de especie (Kurtzman CP, Fell JW, 2011). Si se alcanza una identidad del 99% o superior al comparar con secuencias depositadas en bases de datos como GenBank o MycoBank, se considera válida la asignación de una levadura a una especie concreta.

Para amplificar el dominio D1/D2, se utilizan con frecuencia los cebadores NL-1 (5’–GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG–3’) y NL-4 (5’–GGT CCG TGT TTC AAG ACG G–3’) (Kurtzman & Robnett, 1997; Kopsahelis et al., 2009; Clavijo & Calderón, 2011). La disponibilidad de secuencias de referencia en GenBank facilita la identificación de especies, utilizando el algoritmo MEGABLAST para comparar con secuencias tipo (Kurtzman et al., 2015).

En ciertos clados, es posible relacionar agrupaciones evolutivas con aplicaciones biotecnológicas. Por ejemplo, (Kawahata et al., 2007) emplearon una combinación de cebadores (NL1, NL4, ITS5, ITS4, ITS3 e ITS2) para categorizar levaduras industriales. En un estudio de 30 cepas de Saccharomyces cerevisiae, se observaron polimorfismos en la región ITS2 (dos posiciones) y en ITS1 (cuatro posiciones), lo que permitió dividir las cepas en cuatro grupos: levaduras japonesas (sake y shochu), levaduras panaderas, cepas vínicas, y un cuarto grupo compuesto por cepas cerveceras, panaderas y del wiski, también originarias de Japón.

En algunos grupos taxonómicos, la secuenciación de una única región no es suficiente para discriminar entre especies cercanas, lo que ha impulsado el uso de enfoques multigénicos que combinan regiones ribosomales con genes codificantes, tanto del núcleo como de la mitocondria. Esta estrategia ha sido aplicada con éxito en géneros como Candida, Kuraishia, Nakazawaea (Kaewwichian & Limtong, 2014), Cystobasidium y Kazachstania, entre otros.

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) del DNA mitocondrial (mtDNA)

El DNA mitocondrial de las levaduras está compuesto por una única molécula circular de doble cadena con una longitud aproximada de entre 75 y 85 kilobases (kb). Al igual que ocurre en la mayoría de los organismos eucariotas, las mitocondrias de levadura codifican solo una pequeña fracción de las proteínas necesarias para su funcionamiento, ya que la mayoría son codificadas en el núcleo y posteriormente importadas al orgánulo.

Existe una clase de mutantes mitocondriales denominada petite, caracterizada por la pérdida parcial o total del DNA mitocondrial. Estas deleciones provocan que las mitocondrias pierdan su funcionalidad, particularmente en lo que respecta a la síntesis proteica necesaria para la respiración celular. Como resultado, las cepas petite son incapaces de realizar respiración aerobia, aunque sí pueden sobrevivir mediante fermentación en condiciones anaerobias.

En Saccharomyces cerevisiae se ha identificado también la presencia de un plásmido circular de DNA de doble cadena, conocido como plásmido de 2 μm. Este plásmido tiene una longitud cercana a los 6,3 kb y se encuentra en abundancia dentro del citoplasma, con un número de copias que varía entre 60 y 100 por célula.

En 1992, Querol y colaboradores desarrollaron un método que permitió analizar el DNA mitocondrial (mtDNA) sin necesidad de utilizar gradientes de cesio ni realizar la purificación previa de las mitocondrias. Esta innovación supuso una mejora significativa en términos de rapidez y simplicidad del procedimiento.

La base de esta técnica radica en la diferencia en la composición de bases nitrogenadas entre el DNA mitocondrial y el nuclear. El mtDNA presenta un alto contenido en adenina y timina (A+T), alcanzando aproximadamente un 75%, mientras que su proporción de guanina y citosina (G+C) es baja, cercana al 20%. Por el contrario, el DNA nuclear tiene un contenido más equilibrado y, por tanto, es más susceptible a ser fragmentado por enzimas de restricción con sitios ricos en G y C.

Cuando se realiza una digestión enzimática sobre DNA total, las enzimas que reconocen secuencias como GANTC (donde N representa cualquier base) o GGCC producirán pocos cortes en el mtDNA, permitiendo que sus fragmentos se visualicen claramente como bandas definidas en geles de agarosa. En cambio, el DNA nuclear se fragmentará en segmentos pequeños que no resultan detectables en el gel.

Es importante señalar que los patrones obtenidos en la electroforesis dependen tanto de la enzima utilizada como de la especie de levadura analizada. En el caso de Saccharomyces cerevisiae, las enzimas de restricción más recomendadas son Hinf I y Hae III. Para muestras procedentes de poblaciones desconocidas, se ha sugerido el uso de Hinf I o Rsa I, según lo indicado en la resolución OIV-OENO 408-2011.

En este tipo de análisis, Hinf I se emplea con frecuencia debido a que existe una base de datos amplia sobre los patrones generados con esta enzima, lo que facilita la interpretación y comparación de resultados. La sencillez del protocolo ha hecho que esta técnica se utilice ampliamente en estudios de caracterización mitocondrial en levaduras.

Cariotipo mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)

El DNA genómico de las levaduras puede ser analizado mediante una técnica que implica su digestión con enzimas de restricción de corte poco frecuente, seguida de su separación en un gel de agarosa usando electroforesis en campo pulsado (PFGE). Este método aplica pulsos eléctricos alternos desde distintos ángulos, lo que permite redirigir continuamente la migración de las moléculas de DNA, evitando que queden atrapadas en la matriz del gel. Gracias a esta técnica, es posible resolver fragmentos de DNA superiores a los 225 kilobases (kb). Para garantizar la precisión en la interpretación de los geles, se utilizan estándares cromosómicos comerciales de S. cerevisiae.

La PFGE permite detectar reordenamientos cromosómicos, como translocaciones, deleciones o amplificaciones, característicos del elevado grado de polimorfismo observado en el genoma de las levaduras. Estas variaciones estructurales entre cepas se manifiestan como diferencias de tamaño en los cromosomas, facilitando su estudio a través de esta técnica. Se ha demostrado que la recombinación entre las secuencias repetidas del tipo Ty, ampliamente distribuidas en el genoma, es una de las principales causas de estos reordenamientos (König et al., 2009).

La cariotipificación mediante PFGE también se ha empleado para estudiar cepas implicadas en fermentaciones vínicas (Infante et al., 2003; Mesa et al., 1999; Rodríguez et al., 2013), así como para la identificación de Dekkera bruxellensis en vinos, una levadura conocida por generar alteraciones organolépticas indeseadas y pérdidas económicas importantes (Mitrakul et al., 1999). En S. cerevisiae, los perfiles polimórficos generados por PFGE reflejan eventos evolutivos como inserciones o deleciones de fragmentos largos de DNA en cromosomas homólogos (Casaregola et al., 1998). Aunque esta técnica ofrece gran resolución en la caracterización de cepas individuales, su aplicabilidad es limitada frente a un amplio espectro de especies contaminantes, debido a los polimorfismos interespecíficos. Además, su ejecución requiere equipos especializados y tiempo considerable, lo que restringe su uso en análisis rutinarios (Hage & Houseley, 2013).

RAPD (polimorfismo de DNA amplificado al azar)

La técnica RAPD-PCR permite amplificar aleatoriamente fragmentos del DNA genómico utilizando cebadores de secuencia arbitraria, generando patrones únicos de bandas tras su visualización por electroforesis, conocidos como “huellas digitales” (Capece et al., 2010). Esta herramienta es útil para detectar diferencias genéticas entre especies o cepas de levaduras, especialmente en fermentaciones espontáneas donde no se emplean cepas comerciales. Mediante esta metodología, se pueden seleccionar levaduras autóctonas con características deseables para la vinificación. Además, los resultados pueden complementarse con análisis filogenéticos usando coeficientes como el de Dice y métodos de agrupamiento como UPGMA, lo cual permite evaluar relaciones genéticas entre cepas mediante software especializado como NTSYSpc y TFPGA (Gallego et al., 2005).

La técnica RAPD-PCR también ha sido empleada para analizar la variabilidad genética dentro del grupo Saccharomyces sensu stricto, diferenciando entre especies muy relacionadas como S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus y S. pastorianus, así como entre grupos intraespecíficos (Nardi et al., 2006). Gracias a su carácter multilocus, RAPD permite detectar el origen híbrido de algunas especies, identificando fragmentos de DNA compartidos entre híbridos y sus cepas parentales. Aunque su principal ventaja es que no requiere información previa sobre la secuencia del DNA y puede revelar polimorfismos a lo largo de todo el genoma, la baja temperatura de hibridación hace que sus resultados sean poco reproducibles, por lo que se necesitan múltiples repeticiones y el uso de varios iniciadores para mejorar la resolución. A pesar de estas limitaciones, sigue siendo una herramienta molecular ampliamente utilizada en estudios de diversidad genética, aunque su reproducibilidad puede verse afectada por las condiciones experimentales.

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

La técnica AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) se presenta como una herramienta poderosa para el análisis genético y la caracterización de levaduras, especialmente útil para discriminar entre cepas a un nivel de resolución superior al de otras técnicas como los RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Al igual que los RAPD, los AFLP no requieren información previa sobre la secuencia del genoma para el diseño de los cebadores, lo que representa una ventaja importante en el estudio de organismos con genomas poco caracterizados. No obstante, a diferencia de los RAPD, los AFLP ofrecen una mayor reproducibilidad, lo cual los convierte en una opción más robusta y fiable para estudios de diversidad genética.

El procedimiento de AFLP implica varias etapas. Primero, el DNA genómico es digerido con enzimas de restricción, comúnmente una combinación de enzimas de corte frecuente y poco frecuente (por ejemplo, EcoRI y MseI). Posteriormente, se ligan adaptadores específicos a los extremos de los fragmentos generados. Estos adaptadores sirven como sitios de anclaje para los cebadores en la etapa de PCR. La primera ronda de amplificación es una PCR no selectiva, en la que se utilizan iniciadores complementarios a las secuencias de los adaptadores. Luego, se realiza una segunda PCR, más selectiva, que incorpora entre uno y tres nucleótidos adicionales en el extremo 3’ de los cebadores, lo que reduce el número de fragmentos amplificados y mejora la resolución del análisis. Finalmente, los productos de amplificación se separan por electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes, permitiendo visualizar entre 50 y 100 fragmentos de restricción por genoma de levadura (Javier Gallego et al., 2005).

Estudios comparativos han demostrado que los AFLP superan a los RAPD en su capacidad discriminatoria. Por ejemplo, (Javier Gallego et al., 2005) analizaron la eficacia de tres técnicas moleculares —RAPD, AFLP y SSR (Simple Sequence Repeats)— para caracterizar 27 cepas de Saccharomyces cerevisiae vinícolas procedentes de la denominación de origen “Vinos de Madrid”, en España. Los resultados indicaron que tanto AFLP como SSR ofrecieron un poder de discriminación similar y claramente superior al de los RAPD, logrando diferenciar 23 de las 27 cepas estudiadas, lo que evidencia el alto nivel de resolución genética alcanzado con estas metodologías.

Debido a su sensibilidad, los AFLP se emplean también como técnica confirmatoria en la identificación de levaduras silvestres aisladas de ambientes fermentativos complejos, como los tanques de almacenamiento de melaza de caña. En un estudio realizado por (Castillo et al., 2016), se utilizó AFLP junto con marcadores interdelta 12-21 para caracterizar cepas tolerantes a vinazas. A partir de esta metodología, se identificaron cinco grupos genéticos distintos, con diferencias entre ellos que oscilaban del 15 al 30%. Además, análisis bioquímicos confirmaron que el 85% de los aislamientos correspondían al género S. cerevisiae, reforzando el valor del AFLP como una herramienta robusta para estudios intraespecíficos.

Pese a su efectividad, la adopción de los AFLP en laboratorios microbiológicos de la industria aún es limitada. Esto se debe principalmente a la complejidad técnica del procedimiento, el elevado número de pasos, la necesidad de reactivos específicos y la utilización de geles de poliacrilamida de gran tamaño para la separación de fragmentos, lo cual requiere equipamiento especializado. No obstante, se han propuesto simplificaciones que permiten reducir los costos y mejorar la accesibilidad, como la visualización de los productos en geles de agarosa al 2% en tampón TBE 1%. Este enfoque fue aplicado por (Wang et al., 2016) durante la caracterización de la biota de levaduras presentes en una fermentación espontánea de mosto de uva en Tarragona, España, demostrando que es posible adaptar la técnica a contextos menos equipados sin perder fiabilidad.

En conclusión, los AFLP constituyen una técnica molecular altamente eficaz para el análisis genético de levaduras, con una capacidad de resolución superior a la de métodos como RAPD. A pesar de las barreras logísticas que aún limitan su uso rutinario en entornos industriales, las recientes adaptaciones metodológicas abren nuevas posibilidades para su implementación en estudios de biodiversidad microbiana y control de calidad en procesos fermentativos. Su aplicación permite no solo discriminar cepas autóctonas valiosas, sino también trazar relaciones filogenéticas y monitorear poblaciones de levaduras a lo largo del tiempo.

Elementos delta del transposón Ty1 y 2 de levaduras

Las secuencias delta constituyen elementos genéticos repetitivos de aproximadamente 330 pares de bases, que se localizan flanqueando los retrotransposones Ty1 y Ty2 en el genoma de Saccharomyces cerevisiae (Cameron et al., 1979). Además de estar asociadas a dichos transposones, estas secuencias también pueden encontrarse de forma dispersa e independiente a lo largo del genoma, en cuyo caso se les denomina simplemente elementos delta. La distribución y el número de estas secuencias son características específicas de cada cepa y se han reportado como genéticamente estables a lo largo de al menos 50 generaciones (Eigel & Feldmann, 1982). En total, se han identificado aproximadamente cinco familias de retrotransposones Ty, las cuales contienen en conjunto unos 50 sitios potenciales para la transposición activa, además de cerca de 300 copias dispersas de elementos delta, considerados como reliquias de eventos pasados de inserción.

Un aspecto de gran interés en estos elementos es su tendencia a acumularse en regiones próximas a genes tRNA, lo cual sugiere una cierta preferencia estructural en su inserción genómica. Esta variabilidad natural en la ubicación y el número de elementos delta ha sido aprovechada como una herramienta molecular para estudios de tipificación genética. En este contexto, (Ness et al., 1993) fueron pioneros en el desarrollo de un método de identificación de cepas basado en PCR, utilizando cebadores específicos para las regiones delta (denominados δ1 y δ2). La técnica permitió amplificar regiones interdelta y generar perfiles moleculares específicos para distintas cepas de S. cerevisiae, lo que demostró su utilidad como marcador genético para estudios de diversidad intraespecífica, incluso en ambientes industriales.

Estudios posteriores reforzaron estas conclusiones, demostrando que la técnica basada en interdelta-PCR ofrece una capacidad de discriminación comparable, o incluso superior, a otras metodologías como el análisis de restricción de DNA mitocondrial (mtDNA-RFLP) o la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) (Fernández-Espinar, 2001; Pramateftaki et al., 2000). No obstante, como en toda técnica molecular, surgieron desafíos técnicos iniciales. La reproducibilidad del método se vio afectada por variables como la concentración de DNA y la baja temperatura de hibridación de los cebadores (alrededor de 42 °C), lo cual podía generar inconsistencias entre réplicas.

Para mejorar la resolución del análisis y optimizar el protocolo, (Legras & Karst, 2003) diseñaron dos nuevos iniciadores, denominados δ12 y δ21, localizados en regiones cercanas a δ1 y δ2. Su combinación permitió aumentar el polimorfismo detectable, generando perfiles con un mayor número de bandas amplificadas. Posteriormente, (Schuller et al., 2005) confirmaron que el par δ2/δ12 tenía una capacidad de discriminación casi el doble que la obtenida con el par de cebadores original. A su vez, otros autores propusieron mejorar la reproducibilidad del análisis mediante el uso de concentraciones de DNA estandarizadas y un aumento en la temperatura de hibridación hasta 55 °C, lo que resultó en perfiles más estables, aunque con un leve descenso en el número de fragmentos amplificados (Ciani & Comitini, 2011).

Dado su bajo coste, relativa facilidad de ejecución y alta resolución en estudios intraespecíficos, la técnica de huella genética interdelta continúa siendo una herramienta valiosa en la identificación y monitoreo de cepas de S. cerevisiae, especialmente en entornos fermentativos tradicionales y espontáneos.

Secuencias de mini/microsatélites como cebadores (SSR-MSP-PCR Fingerprinting)

La técnica conocida como PCR basada en secuencias repetitivas, también llamada microsatellite-primed MSP-PCR o simple sequences repeats SSR-PCR (si se utilizan varios cebadores PCR multiplexada) con cebadores de secuencias repetitivas, es una herramienta molecular útil para el estudio de la variabilidad genética entre cepas de levaduras y otros microorganismos. Esta técnica utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar regiones del DNA genómico que contienen secuencias repetitivas simples, conocidas como minisatélites, cuya longitud oscila entre 10 y 100 pares de bases. En contraste, los microsatélites se caracterizan por tener repeticiones más cortas, usualmente menores a 10 pb.

Los cebadores empleados en esta técnica están diseñados para unirse específicamente a estas regiones repetitivas. Entre los más utilizados en estudios de levaduras se encuentran secuencias como (GTG)₅, (GACA)₄, el DNA del fago M13 y la secuencia derivada del mismo M13: GAGGGTGGCGGTTCT. La selección de estos cebadores permite generar un patrón de bandas característico para cada cepa, útil para su diferenciación y clasificación.

Una de las principales ventajas de esta técnica frente a otras como el RAPD (polimorfismo de DNA amplificado al azar) radica en su mayor reproducibilidad. Esto se debe principalmente a la temperatura de hibridación más alta utilizada durante la PCR entre 50 y 55 °C, que favorece una unión más específica entre el cebador y el DNA molde. En cambio, el RAPD se realiza a temperaturas más bajas (alrededor de 37 °C), lo que incrementa la probabilidad de hibridaciones inespecíficas y, por tanto, reduce la consistencia de los perfiles obtenidos.

El uso de cebadores específicos para regiones repetitivas ha demostrado ser particularmente útil para la tipificación de cepas de Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras de género Saccharomyces de interés en fermentaciones industriales, como las involucradas en la elaboración de vino, cerveza y pan. Este enfoque ha sido ampliamente validado en la literatura científica, ya que permite generar perfiles moleculares comparables entre laboratorios y estudios, algo fundamental en investigaciones de biodiversidad microbiana y programas de mejoramiento de cepas.

La técnica SSR-PCR multiplex, basada en la amplificación de microsatélites o Short Sequence Repeats (SSR), es una herramienta molecular ampliamente utilizada en la caracterización genética de levaduras con varias parejas de “primers”. El elevado nivel de variabilidad genética de Saccharomyces cerevisiae los convierte en marcadores ideales para estudios de diversidad genética, identificación de cepas y análisis de trazabilidad en procesos fermentativos (Legras et al., 2005).

En el método SSR-PCR multiplex, se diseñan cebadores específicos para varias regiones microsatélites que pueden amplificarse simultáneamente en una sola reacción de PCR. A diferencia de técnicas como RAPD, que utilizan cebadores de secuencia arbitraria, en el análisis de SSR es necesario conocer las secuencias flanqueantes de los microsatélites para diseñar los oligonucleótidos. Esta característica aporta una mayor especificidad, reproducibilidad y capacidad de discriminación (Schuller et al., 2004).

Uno de los principales beneficios del formato multiplex es la posibilidad de amplificar múltiples loci microsatélites en una sola reacción, lo que reduce significativamente el tiempo de procesamiento, el consumo de reactivos y el coste por muestra. Para lograr esto, los cebadores deben estar cuidadosamente optimizados para evitar interferencias cruzadas, y los productos de PCR deben diferenciarse fácilmente, por ejemplo, mediante el uso de fluoróforos distintos o diferencias de tamaño detectables por electroforesis capilar (Vaudano & Garcia-Moruno, 2008).

La técnica se ha aplicado extensamente en el análisis de Saccharomyces cerevisiae, especialmente en el ámbito enológico, donde permite distinguir cepas autóctonas de interés tecnológico de aquellas contaminantes o comerciales. Legras et al. (2005) desarrollaron un conjunto de 12 loci microsatélites que permitió discriminar eficazmente más de 300 cepas de S. cerevisiae aisladas de diferentes regiones vitivinícolas del mundo, demostrando su gran poder de resolución y utilidad para estudios poblacionales.

Además, los SSR multiplex también han sido utilizados para estudiar dinámicas microbianas durante procesos fermentativos. En un estudio realizado por Schuller et al. (2005), se monitorizó la población de levaduras en fermentaciones espontáneas e inoculadas, demostrando que los SSR permitieron detectar con precisión la sustitución de cepas dominantes a lo largo del tiempo, lo que no se podía observar con métodos menos resolutivos reduciendo la amplificación a 6 loci.

Posteriormente, Vaudano y García-Moruno (2008) emplearon este método para tipificar 30 cepas comerciales de levaduras vínicas. Utilizaron una PCR multiplex basada en tres loci altamente polimórficos: SC8132X, YOR267C y SCPTSY7, seguida de electroforesis en gel y análisis comparativo de los patrones de bandas generados. Esta aproximación permitió una diferenciación clara y eficiente entre las cepas estudiadas.

En 2016, (Börlin et al., 2016) caracterizaron la estructura poblacional de más de 653 aislamientos de Saccharomyces cerevisiae procedentes de tres bodegas francesas ubicadas a menos de 10 km entre sí. Utilizando 15 loci de microsatélites como marcadores moleculares, identificaron 503 genotipos distintos. A partir del análisis de SSR y mediante índices específicos relacionados con el origen de las poblaciones, lograron evidenciar cierto solapamiento genético entre dos de las tres bodegas, así como la presencia de un clúster local y estable de cepas con un ancestro común que persistió durante más de dos décadas. Los autores destacaron que el análisis basado en microsatélites (SSR) ofrece mayor robustez y sensibilidad en comparación con otras técnicas como el análisis interdelta, la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y los perfiles de DNA mitocondrial mediante RFLP.

En el año 2020, (Rex et al., 2020) validaron un método basado en marcadores moleculares tipo microsatélites (SSR) para la diferenciación de cepas de Saccharomyces cerevisiae, utilizando la técnica de PCR en formato multiplex. Este enfoque se fundamenta en el empleo de dos juegos de iniciadores (“primers”) diseñados para amplificar loci polimórficos de diferentes tamaños. La validación se llevó a cabo inicialmente en nueve cepas comerciales ampliamente caracterizadas.

El primer conjunto de multiplex incluye seis iniciadores: ScAAT2, ScAAT3, C5, SCYOR267c, C8 y C11, los cuales permiten generar seis patrones de bandas distintos tras la amplificación por PCR y posterior electroforesis en gel. El segundo conjunto emplea los iniciadores YKL172w, C4, C9, ScAAT5, C6 y YPL009c, obteniéndose cinco perfiles diferenciables. Para confirmar la robustez del método, se compararon las longitudes de los fragmentos amplificados obtenidas mediante secuenciación capilar con las imágenes generadas por electroforesis en gel de agarosa. Posteriormente, este protocolo fue aplicado para caracterizar 50 cepas de S. cerevisiae aisladas de cinco fermentaciones espontáneas distintas. Gracias al uso de estos marcadores SSR, se logró identificar 21 cepas únicas con perfiles aromáticos diversos, demostrando la eficacia del método para estudios de biodiversidad y diferenciación intraespecífica (Rex et al., 2020).

Otra ventaja de esta técnica es su utilidad en estudios de clonación industrial, permitiendo rastrear la dispersión de cepas específicas en distintas bodegas o instalaciones productivas. Por ejemplo, en una investigación sobre levaduras contaminantes en cervecerías, los SSR multiplex fueron clave para vincular aislamientos ambientales con lotes defectuosos de producción, confirmando la reintroducción de cepas previamente detectadas en instalaciones cercanas (Richter et al., 2020).

No obstante, la técnica no está exenta de desafíos. Su implementación requiere equipamiento especializado y software específico para el análisis de datos genotípicos y hasta el momento solo está disponible para especies de levaduras del género Saccharomyces.

El análisis por SSR-PCR multiplex representa una técnica altamente discriminatoria, reproducible y eficiente para el estudio genético de levaduras, especialmente en especies del género Saccharomyces. Su aplicación permite caracterizar cepas a nivel intraespecífico, estudiar relaciones filogenéticas, evaluar dinámicas poblacionales durante la fermentación y reforzar sistemas de trazabilidad en la industria alimentaria y biotecnológica.

Análisis por MALDI-TOF

La espectrometría de masas acoplada a desorción/ionización por láser asistida por matriz con análisis por tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS, por sus siglas en inglés: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry) se ha consolidado como una técnica de referencia para la identificación rápida y precisa de microorganismos, incluidas diversas especies de levaduras. Este método ha revolucionado el diagnóstico microbiológico por su alta capacidad de discriminación, velocidad de análisis y bajo coste por muestra una vez que el sistema está implementado.

El principio de MALDI-TOF MS consiste en ionizar las proteínas celulares (principalmente ribosomales) mediante un láser, tras mezclarlas con una matriz química específica, usualmente el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico. Una vez ionizadas, estas proteínas viajan a través de un tubo de vuelo en función de su masa/carga (m/z), generando un espectro característico de picos que actúa como una “huella digital proteica” específica para cada especie, e incluso cepa, de levadura.

Para la identificación de levaduras, se requiere una preparación previa que puede realizarse mediante protocolos directos (uso de colonias sin tratamiento químico) o indirectos, que implican una extracción previa de proteínas con etanol y ácido fórmico, lo que mejora la calidad del espectro. Una vez obtenida la muestra tratada, se mezcla con la matriz en una placa diana y se deja cristalizar. Posteriormente, se analiza en el espectrómetro de masas (Patel, 2019).

El espectro obtenido se compara con bases de datos especializadas que contienen perfiles proteicos de referencia. Estas bibliotecas pueden estar incluidas en el software del equipo (como Biotyper de Bruker o SARAMIS de bioMérieux) o ser personalizadas, lo cual es útil para identificar cepas industriales o aislamientos ambientales no representados en las bases de datos estándar.

Sin embargo, presenta ciertas limitaciones. Por ejemplo, su capacidad para discriminar levaduras muy cercanas filogenéticamente depende directamente de la calidad y amplitud de la base de datos utilizada. Además, su sensibilidad puede verse reducida si las muestras presentan impurezas, contaminantes o si la extracción proteica no es adecuada.

Tecnología de secuenciación por nanoporos

El secuenciador MinION, desarrollado por Oxford Nanopore Technologies, representa una herramienta de gran interés. Este dispositivo de secuenciación de tercera generación se caracteriza por su tamaño compacto, conexión vía USB, capacidad de análisis en tiempo real, lectura de fragmentos largos de DNA, y bajo coste de adquisición (6,7). Aunque originalmente no fue diseñado para su uso en industrias alimentarias o de bebidas, el MinION ha sido adaptado para laboratorios de calidad cervecera y del vino mediante el desarrollo de protocolos simplificados y más rápidos que los sugeridos por el fabricante (Shinohara et al., 2021). Este dispositivo es portátil, de bajo coste y permite la secuenciación en tiempo real tanto de DNA como de RNA.

Recientemente, (Kurniawan et al., 2021) desarrollaron y validaron una plataforma de identificación microbiana basada en el secuenciador MinION, inicialmente aplicada a bacterias contaminantes de la cerveza. Posteriormente dicha plataforma se utilizó para la identificación de cepas de levaduras contaminantes (Shinohara et al., 2021). Se llevó a cabo la secuenciación de los genes del RNA ribosomal nuclear y de las regiones espaciadoras internas transcritas (ITS) de una amplia variedad de levaduras relacionadas con el deterioro cervecero, comunes en ambientes de producción de cerveza. Para ello, se emplearon dos kits de secuenciación diferentes: el Ligation Sequencing Kit y el Rapid Barcoding Kit. El análisis de las secuencias se realizó utilizando un enfoque basado en la generación de secuencias consenso.

Como parte de la evaluación del desempeño del MinION, se realizó una comparación directa con la técnica de secuenciación Sanger. Los resultados obtenidos demostraron que el método implementado con MinION permite identificar levaduras a nivel de especie de forma rápida (aproximadamente 3,5 horas desde la extracción del DNA hasta el análisis de los datos), y con una precisión comparable a la secuenciación Sanger, alcanzando una identidad promedio superior al 98,9%.

La plataforma de identificación microbiana basada en MinION, ahora adaptada tanto para bacterias como para levaduras, representa una herramienta eficaz para la identificación rápida y precisa de microorganismos asociados al deterioro de la cerveza, directamente en campo o en las instalaciones de producción. Este nuevo enfoque tiene el potencial de transformar los procesos de control y aseguramiento de calidad microbiológica en las cervecerías y bodegas, ofreciendo una alternativa innovadora y práctica frente a los métodos convencionales.