Las aminas biógenas son bases orgánicas dotadas de actividad biológica que provienen esencialmente de la descarboxilación de los aminoácidos. Están presentes en diversos alimentos y bebidas de forma natural, como consecuencia de un proceso normal de fermentación o de una alteración microbiana. Las principales aminas biógenas descritas en el vino son: putrescina, cadaverina, agmatina, espermidina y espermina (alifáticas), tiramina y 2-feniletilamina (aromáticas) e histamina y triptamina (heterocíclicas). En el vino están presentes además aminas volátiles, con escasa actividad biológica aunque sí sensorial, que proceden de la aminación del correspondiente aldehído o de la transaminación del aldehído a partir de un aminoácido. Entre ellas, se han descrito: metilamina, pirrolidina, morfolina, isoamilamina, etilamina, hexilamina, isopropilamina, isobutilamina, n-butilamina, n-amilamina, dimetilamina, n-propilamina, etanolamina, 3-metiltiopropilamina.
Métodos de análisis
Los primeros estudios sobre la formación de aminas biógenas en vinos se realizaron utilizando métodos espectrofluorométricos con los que solo se valoraban algunas aminas de forma individual como la histamina1-3 o la tiramina, con lo que la información obtenida sobre la formación de aminas biógenas en el vino con estos métodos es sólo parcial. En estudios posteriores se ha utilizado la cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) que permite determinar de forma simultánea todas las aminas presentes.
La cromatografía de líquidos de alta eficacia con detección en UV o en fluorescencia es el método más utilizado para la determinación de aminas en vinos. Debido a la ausencia de cromóforos en estos compuestos es necesario formar derivados que absorban en ultravioleta o que sean fluorescentes, con el fin de facilitar su detección. El cloruro de dansilo y el ortoftaldehído (OPA) son los reactivos más utilizados. En el caso del cloruro de dansilo, la reacción se realiza antes de la separación cromatográfica,4 en el del OPA se puede hacer antes de la columna5-7 o después.8 Otros reactivos derivatizantes utilizados, aunque de una forma menos general, son el cloruro de dabsilo9 y el 9-fluorenilmetoxicarbonioxi succinimida (Fmoc-OSu).10 De todos estos derivados, el más utilizado es el OPA, debido entre otras razones a que la reacción de derivatización es rápida y de un solo paso y a la posibilidad de automatizar la reacción, lo que influye positivamente en la reproducibilidad del método de análisis. Los resultados del método de HPLC de los OPA-derivados de la histamina, se han comparado con los del inmunoanálisis CD-ELISA para esta amina, obteniendo resultados concordantes.11 El método ELISA por su simplicidad, rapidez y bajo coste, puede ser considerado como una alternativa a la HPLC y puede ser utilizado al menos como método de screening en laboratorios en los que no disponen de cromatógrafos o que tienen que analizar un número elevado de vinos. Recientemente se ha publicado el desarrollo de un método enzimático para la determinación de histamina en vinos y se ha comparado con el de HPLC,12 obteniendo una buena correlación de los resultados obtenidos con ambos métodos.
La cromatografía de gases se ha aplicado también al análisis de aminas,13 pero esta técnica muy adecuada para el análisis de compuestos volátiles no lo es tanto para el de los no volátiles. Es necesario no sólo extraer las aminas, sino formar derivados volátiles, lo que alarga y complica el análisis. También se han descrito algunas aplicaciones de la electroforesis capilar al análisis de aminas. En este caso también es necesario formar derivados detectables en ultravioleta14 o en fluorescencia.15 Esta técnica no se está aplicando aún para análisis de rutina aunque es posible que se imponga en unos años.
Formación de aminas biógenas por las levaduras
Aunque existe un acuerdo en general entre los diversos autores atribuyendo a las bacterias lácticas el principal origen de la formación de aminas biógenas en el vino, existen algunos estudios dirigidos a conocer la participación de las levaduras en la formación de estos compuestos. Algunos de estos estudios se han realizado en cervezas. Abajo puede verse, en la tabla, un resumen a modo de ejemplo, algunos datos de la bibliografía sobre las concentraciones de aminas biógenas producidas por levaduras. Somavilla et al.1 comprobaron, utilizando seis cepas de levaduras, que durante la fermentación alcohólica producían pequeñas cantidades de histamina y que la asociación de levaduras con bacterias lácticas da lugar a una disminución del nivel de histamina. Los valores más altos de histamina (de 3,7 a 8,3 mg/L) se obtienen cuando al mosto se le añade histidina (34 mg/L), en el resto de las experiencias los valores de histamina obtenidos son menores de 1,2 mg/L. La formación de histamina y tiramina por S. cerevisiae, var. uvarum ha sido estudiada por Izquierdo-Pulido et al.16 durante la fermentación alcohólica en la elaboración de cerveza, concluyendo que esta levadura no forma aminas biógenas. Según estos autores, las pequeñas cantidades que aparecen en la cerveza se deben a la materia prima y discrepan de los resultados obtenidos por otros autores que indican que se forman por levaduras, y concluyen que la formación de aminas se debe a la presencia de contaminantes. Tampoco Vidal-Carou et al.17 han detectado la formación de histamina durante la fermentación alcohólica, aunque sí de tiramina, pero en muy baja concentración (0,60 mg/L).
Más recientemente, Caruso et al.18 han valorado la capacidad de formar aminas biógenas de un total de 50 cepas de levaduras de las especies Saccharomyces cerevisiae, Kloeckera apiculata, Candida stellata, Brettanomyces bruxellienses y Metschnicowia pulcherrima, y comprueban que la producción de histamina por todas las cepas es muy pequeña o incluso no detectable, mientras que las aminas biógenas metilamina y agmatina se forman por todas las especies consideradas. La mayor concentración de aminas biógenas totales se formó por B. bruxellensis con un valor medio de 15 mg/L, seguido por S. cerevisiae con una media de 12,14 mg/L. Las otras especies forman menos de 10 mg/L de aminas biógenas totales.
| AMINA | REFERENCIA | |||
| Somavilla et al. 1 | Ulla et al.2 | Vidal-Carou et al.3 | Caruso et al.18 | |
| Etanolamina | 0-5,98 | |||
| Metilamina | 0,25-0,98 | |||
| Agmatina | 1,12-4,11 | |||
| Triptamina | 0-0,80 | |||
| 2-feniletilamina | 0-10,07 | |||
| Histamina | <1,2 | 0-0,20 | ||
| Tiramina | 1,11 | 0,6 | ||
| Putrescina | 0-1,18 | |||
| Cadaverina |
0-0,68 | |||
Formación de aminas biógenas por bacterias lácticas
Existen trabajos en los que se han aislado cepas de bacterias lácticas enológicas productoras de aminas biógenas, generalmente a partir de vinos con elevados contenidos en estas aminas, que posteriormente se han caracterizado a nivel bioquímico y molecular.
Los primeros estudios sobre la producción de histamina por bacterias lácticas, indicaban que los Pediococcus eran los principales productores.19 Sin embargo, posteriormente, los estudios de un equipo francés demostraron la presencia de actividad histidina descarboxilasa en Oenococcus oeni, la especie más frecuentemente detectada en vinos durante la fermentación maloláctica,20 comprobando que la presencia de enococos con capacidad de producción de esta amina es frecuente en vinos franceses.21
En el mismo laboratorio, se puso de manifiesto que en la producción de tiramina están implicadas determinadas especies del grupo de los lactobacilos, fundamentalmente Lactobacillus brevis y L. hilgardii.22 Como en el caso de la histamina, se comprobó que la capacidad de producción de tiramina no es característica de una especie bacteriana, sino que depende de la cepa.23 Estos resultados se han confirmado posteriormente en estudios realizados en nuestro laboratorio [resultados sin publicar]. Recientemente, también se ha puesto de manifiesto la producción de histamina y de tiramina por cepas de enococos y de lactobacilos, respectivamente, aisladas de vinos españoles.24
También en nuestro laboratorio hemos abordado el estudio de la producción de putrescina por bacterias lácticas en condiciones de vinificación y en medios de cultivo de laboratorio. En este caso, se ha aislado e identificado una cepa de la especie O. oeni, productora de putrescina y se ha evaluado la capacidad de producción de esta amina por otras 42 cepas de esta especie, comprobándose que en ninguna de ellas está presente el gen que codifica la biosíntesis de esta amina.25 Estos resultados indican que, si bien esta especie puede estar implicada en la producción de putrescina en vinos, esta propiedad no es frecuente.
Consideraciones finales
De la diversidad de métodos de que se dispone en la literatura para la determinación de la concentración de aminas biógenas en vinos, la cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) de los derivados de la OPA es el método más utilizado porque es el que da una mayor información de todas las aminas del vino y la HPLC es una técnica cada vez mas difundida en el laboratorio. Sin embargo, están apareciendo métodos para la determinación de histamina (métodos ELISA o enzimáticos) que permiten la determinación de esta amina en un período corto y que no requiere una instrumentación sofisticada.
Los resultados obtenidos en los escasos estudios dirigidos a estudiar la formación de aminas biógenas por levaduras no son coincidentes e indican que no todas las especies (ni siquiera todas las cepas de levadura) dan lugar a una o varias de las aminas estudiadas. En los ensayos en los que se ha detectado la formación de aminas por levaduras las concentraciones obtenidas son muy pequeñas y en cualquier caso alejadas de los valores considerados como tóxicos en el vino.
De los datos publicados se desprende que las bacterias lácticas del vino varían en su capacidad para producir aminas biógenas a partir de aminoácidos. Parece que los lactobacilos son los principales productores de tiramina y que los pediococos pueden estar implicados en la producción de histamina. Aunque se ha demostrado que los enococos pueden ser productores de histamina y putrescina, parece que esta propiedad es variable y sólo está presente en determinadas cepas, lo que justifica que en algunos estudios no se hayan encontrado cepas de O. oeni productoras de aminas.23, 26
Evidentemente, la amplia distribución observada en la concentración de aminas biógenas en los vinos es atribuible no sólo a la gran variabilidad de las cepas bacterianas en su capacidad de producir estas aminas, sino que también depende de los procesos tecnológicos que emplee el elaborador. Incluso es frecuente encontrar diferencias cuali y cuantitativas cuando se comparan distintos lotes de elaboración de un mismo tipo de vino. Esto indica que la formación de aminas biógenas en el vino, como en otros productos alimentarios, es el resultado de una compleja interacción de factores que influyen no sólo en la presencia sino también en la actividad de diferentes microorganismos implicados en los procesos fermentativos o incluso contaminantes. El empleo de cultivos iniciadores seleccionados está reconocido como una de las principales estrategias tecnológicas para prevenir la acumulación de aminas biógenas, no obstante también es importante conocer la eficacia de estos cultivos, ya que además de ser seguros desde el punto de vista de formación de aminas, debe de estar garantizada su implantación en las condiciones particulares de elaboración de cada tipo de vino. El seguimiento del proceso de elaboración, y especialmente de las etapas críticas, resulta por tanto de especial interés para evitar la acción de microorganismos con capacidad de producción de aminas biógenas, y así controlar la presencia y concentración de estos compuestos durante la elaboración del vino.
Agradecimientos
Este trabajo se ha realizado con la financiación del Proyecto del Ministerio de Ciencia y Tecnología AGL2003-02436.
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