El uso de levaduras no Saccharomyces es una tendencia cada vez más actual en la elaboración de vinos. Las razones de su utilización son diversas, como por ejemplo, la mejora de la calidad aromática de los vinos, mayor complejidad, mayor producción de glicerol o disminución de etanol. Además, dichas levaduras han merecido la atención de otros artículos de esta serie, derivados del congreso de la ACE celebrado recientemente. El proyecto europeo WILDWINE (EU-FP7-SME-2012), próximo a su finalización, utiliza estas especies de levaduras en otra dirección: la defensa de la tipicidad de la zona (Mas et al., 2014). Cada vez tenemos más evidencias de que cada zona tiene una población de microorganismos característica, lo que se podría denominar su propia “huella dactilar” (en inglés fingerprint) microbiológica (Bokulich et al., 2013). Dicha población se caracteriza por una composición de unos microorganismos mayoritarios y otros minoritarios, que varían en el tiempo y que tienen una dinámica propia según diferentes aspectos relacionados con el manejo del viñedo y la climatología, entre los más destacados. A pesar de que hay unos rasgos comunes en muchas poblaciones de microorganismos de diferentes zonas, por ejemplo la presencia de poblaciones de levaduras apiculadas de grupo Kloeckera o Hanseniaspora, o de algunas especies anteriormente descritas como Candida stellata (que diferentes revisiones taxonómicas han reorganizado, siendo Candida zemplinina (Starmerella bacillaris) la más habitual en uvas), las cepas de dichas especies o las especies minoritarias aparecen de forma aleatoria, y suelen ser propias de cada zona. Esa composición de microorganismos, si se desarrolla libremente en un mosto (fermentación espontánea) acaba dejando un conjunto de características propias en el vino final, lo que podríamos definir como el “rastro” (en inglés footprint) microbiológico. Este planteamiento es el que ha dirigido la selección de levaduras autóctonas en el proyecto WILDWINE.
Aislamiento de levaduras autóctonas de la zona DOC Priorat
El aislamiento y selección de levaduras se ha realizado durante dos años consecutivos (2012 y 2013), en viñedos y bodegas pertenecientes a la DOC Priorat, mediante la toma de muestras de uvas o de fermentaciones espontáneas de esa zona. Las uvas recolectadas se dejaban fermentar libremente en presencia de pequeñas concentraciones de sulfuroso, en un ambiente estéril para evitar contaminaciones. Tanto en un caso como en otro se pudo observar la aparición de levaduras no Saccharomyces al principio de las fermentaciones, e incluso hasta en fases avanzadas de la fermentación, mientras que al final aparecían sólo levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae, que dominaban la fermentación. Hasta aquí, nada que no supiéramos o no esperásemos, y que incluso, no hubiéramos descrito con anterioridad en la misma zona o similar (Torija et al., 2001, Beltran et al., 2002). Quizás una pequeña salvedad fue la ausencia, casi total, de S. cerevisiae hasta bien entrada la segunda mitad de la fermentación. Las levaduras que encontramos fueron mayoritariamente de las especies Hanseniaspora uvarum y Candida zemplinina como también se ha descrito previamente (Torija et al., 2001). Además, en este aspecto hay alguna novedad: debido a que el proyecto implica a otras áreas más de Europa aparte del Priorat (Burdeos, Piemonte, Peloponeso y Creta), y que actualmente se dispone de técnicas moleculares de tipificación para estas especies no Saccharomyces (microsatélites, RAPD, etc.), se ha podido hacer un estudio comparativo entre las diferentes cepas de las especies aisladas (Masneuf-Pomerade et al., 2015). Las cepas aisladas en las diferentes zonas vitivinícolas son claramente diferentes genéticamente, si bien con los métodos moleculares empleados para su tipificación estas no se han podido agrupar según la zona de origen. Es decir, teniendo un perfil genético de alguna cepa no la podemos asociar inmediatamente a una zona geográfica de aislamiento. Finalmente, la mayor diferencia entre las zonas de estudio se encuentra en dos aspectos: en las levaduras minoritarias encontradas, que en las diferentes zonas estudiadas de Europa no son necesariamente las mismas (en nuestro caso, en la DOC Priorat hemos encontrado Torulaspora delbrueckii, Metschnikowia pulcherrima, Issatchenkia terricola, Zygosaccharomyces sp, Pichia sp, Lachancea thermotolerans, etc.), y en las cepas presentes de cada una de las especies, que en general fue muy reducido, apareciendo prácticamente las mismas cepas mayoritarias en los dos años de estudio en una misma zona. La figura 1 muestra las cepas de H. uvarum aisladas en uvas y mostos de la DOC Priorat durante los dos años de estudio. La tipificación se realizó utilizando la técnica molecular RADP M13 (Fadda et al., 2014).
Selección de cepas de Saccharomyces y no Saccharomyces y diseño del inóculo mixto para utilizarlo en vinificaciones industriales
Para seleccionar las cepas de levaduras que se utilizarían en las fermentaciones industriales, tanto de Saccharomyces como de no Saccharomyces, se realizaron una serie de pruebas fisiológicas en el laboratorio en medios de cultivo y microfermentaciones con medios naturales y sintéticos. Los criterios básicos para la selección se basaron en la capacidad fermentativa, la ausencia o baja producción de compuestos indeseables (acidez volátil, aminas biógenas, SH2, etc…), en la posible aparición de alguna actividad enzimática de interés (presencia de glucosidasas, pectinasas, esterasas, etc.), o bien la producción de compuestos de interés enológico (glicerol). También se tuvo en cuenta la presencia de esas cepas en las fermentaciones espontáneas de dónde se aislaron, así como, la capacidad de imponerse en estudios de competencia masiva. Estas pruebas se realizaron tanto en medios sólidos como en mostos, naturales o sintéticos, dependiendo de las características que nos interesaran.
Una vez seleccionadas las cepas que pudieran tener interés y desechadas aquellas que produjeran algún aspecto perjudicial, se diseñó un consorcio de levaduras no Saccharomyces y de diferentes cepas de la especie S. cerevisiae, para proceder a su uso en vinificaciones industriales reales. Para respetar al máximo la microbiota nativa y reproducir la huella microbiológica del Priorat era necesario mantener, en términos globales, las proporciones de las diferentes especies que se encontraban en las uvas autóctonas. A pesar de que estas proporciones cambian cada año y de un viñedo a otro, sí que hay una tendencias que son las que se utilizaron para realizar las mezclas de levaduras no Saccharomyces, con un mayoría de una cepa de H. uvarum (60%), que era muy mayoritaria en el Priorat, una proporción menor de otra cepa de C. zemplinina (30%) y finalmente T. delbrueckii y M. pulcherrima, estas en proporciones próximas al 5% del total del inóculo inicial. Para el inóculo con cepas S. cerevisiae autóctonas, se escogieron 3 cepas que se inocularon en partes iguales entre ellas (SFB1, SFB2, SL1) (fig. 2).
Una de las limitaciones del trabajo con levaduras aisladas localmente de forma experimental es la producción de la biomasa necesaria para la inoculación en condiciones adecuadas. En primer lugar se trata de un problema de volumen de inóculo: en las condiciones habituales de trabajo en laboratorio hablamos en términos de volúmenes inferiores a un litro, mientras que en bodega podemos hablar en términos de mil litros como mínimo. Este problema de escalado es una primera limitación importante. Un segundo aspecto es la posible contaminación, ya que una pequeña contaminación de levaduras altamente fermentativas (como S. cerevisiae) durante la preparación de los inóculos conllevaría la práctica desaparición de las otras levaduras no Saccharomyces. Por lo tanto es necesario establecer las condiciones necesarias para trabajar con la máxima esterilidad así como establecer un sistema de control de calidad del producto. Es decir, tenemos que comprobar de nuevo por técnicas moleculares la presencia exclusiva de las cepas de nuestro interés en los inóculos que utilizamos. Evidentemente este tipo de producción de biomasa sólo se puede realizar en laboratorios o instalaciones especialmente diseñadas para ello, dada la gran facilidad de contaminación.
Pruebas de inoculación mixta en bodega
Una vez producido el inóculo de las levaduras en las proporciones determinadas de cada especie, estas se inocularon a fermentaciones industriales de
manera similar a como procede habitualmente la bodega colaboradora del Priorat (Bodega Ferrer Bobet). Se realizaron 2 pruebas independientes, una con garnacha tinta y otra con cariñena, y en cada una de ellas se ensayaron 3 combinaciones distintas (cada condición con 1050 L de mosto) (fig. 2). La primera combinación consistía en una inoculación secuencial: se inocularon las 4 especies de no Saccharomyces antes descritas y a las 24 h se inoculó una mezcla de 3 cepas autóctonas de S. cerevisiae. En la segunda combinación se inoculó desde un principio la mezcla de las 3 cepas autóctonas de S. cerevisiae, y en la última combinación sólo se inoculó la cepa de levadura comercial que habitualmente utiliza la bodega para cada una de las variedades. Debido a las particulares condiciones del viñedo del Priorat, esta bodega realiza vinificaciones separadas por parcelas, que en ocasiones pueden ser reducidas y, por lo tanto, tienen depósitos de pequeño volumen, lo que fue una buena ocasión para que el vino que pudiéramos producir fuera después comparable al vino industrial que ellos habitualmente producen. Por lo tanto, los vinos resultantes, se pudieron analizar detalladamente e incluso catar en condiciones completamente comparables a los vinos producidos después de una fermentación alcohólica.
Los resultados se pueden agrupar en dos aspectos; por un lado la evolución de las fermentaciones y de las poblaciones de levaduras, y por otro el aspecto sensorial. Con respecto a la evolución de las fermentaciones, en todos los casos las fermentaciones alcohólicas procedieron de forma efectiva y rápida, sin diferencias significativas respecto a la fermentación inoculada con la cepa comercial de S. cerevisiae. Por lo que respecta a la evolución de las poblaciones, hay que destacar que cuando se inocularon las especies no Saccharomyces estas aparecieron de forma considerable (estimadas en porcentaje sobre el total) hasta mitad de fermentación (fig. 3), mientras que cuando no se inocularon, estas especies ya no se encontraron a las 24 de haber inoculado Saccharomyces (ya sea la cepa comercial o de selección local). Así, pues se ratifica el hecho de la rápida desaparición de las levaduras no Saccharomyces en presencia de S. cerevisiae, por lo que los posibles efectos que pudieran realizar estas especies quedan reducidos a su mínima expresión. En cambio, cuando se produce la inoculación con levaduras no Saccharomyces, su presencia puede permitir su actuación hasta casi el final de la fermentación. Es importante remarcar que todas las colonias de S. cerevisiae aisladas al final de ambas fermentaciones, así como los aislados de H. uvarum, presentaron un patrón electroforético igual al de las cepas inoculadas, por lo que se puede deducir que las cepas inoculadas han sido las responsables principales de la fermentación.
Por lo que se refiere al producto final, se han realizado catas triangulares y en diversas ocasiones se han obtenido resultados claros y significativos con respecto a la posible discriminación de estos vinos. A pesar de que en pruebas de preferencia sólo ha habido algún caso significativo (apuntando como preferidos los vinos con presencia de no Saccharomyces), es de destacar que el hecho de que los vinos realizados con las levaduras autóctonas seleccionadas no se diferencien de los realizados con las levaduras comerciales es señal de la alta calidad de los vinos producidos con estas levaduras.
Conclusión
En definitiva, es importante remarcar que las levaduras no Saccharomyces pueden tener una importancia en el mantenimiento, tanto de la diversidad en las bodegas durante las fermentaciones, como en las características organolépticas que pueden ser definitorias de la tipicidad de un vino. Por lo tanto, la incorporación de este consorcio levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces para fermentaciones alcohólicas industriales podría mejorar las características de los vinos resultantes, simulando una fermentación espontánea, pero con condiciones controladas desde el punto de vista cinético y microbiológico.
Asimismo, los vinos producidos con levaduras seleccionadas reúnen los niveles de calidad exigibles, como mínimo similares a los producidos con levaduras comerciales si no superiores. Se puede considerar, pues, que el proyecto WILDWINE ha cumplido con los objetivos propuestos por lo que respecta a la DOC Priorat.
Estas cepas se han depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) a nombre del Consejo Regulador de la DOC Priorat.
Agradecimientos
Este estudio se enmarca dentro del proyecto Europeo WILDWINE (Ref. 315065). Los autores quieren agradecer a la bodega Ferrer Bobet por su asistencia en las fermentaciones realizadas a escala industrial.
Bibliografía
Beltran G, Torija MJ, no vo M, Ferrer N, Poblet M.; Guillamón, J.M.; Rozès, N.; Mas, A. Analysis of yeast populations during alcoholic fermentation: a six year follow-up study. Systematic and Applied Microbiology 2002; 25: 287-293.
Bokulich NA, Ohta M, Richardson PM, Mills DA. Monitoring Seasonal Changes in Winery-Resident Microbiota. PLoS One 2013; 8 (6): e66437.
Fadda ME, Mossa V, Pisano MB, Deplano M, Cosentino S. Occurrence and characterization of yeasts isolated from artisanal Fiore Sardo cheese. International Journal of Food Microbiology 2004; 95: 51-59.
Masneuf-Pomarede I, Juquin E, Miot-Sertier C, Renault P, Laizet Y, Salin F, Hervé A, Capozzi V, Cocolin L, Colonna-Ceccaldi B, Girard P, Englezos V, Gonzalez B, Mas A, Albertin W. The yeast Candida zemplinina (Starmerella bacillaris) shows high genetic diversity in winemaking environments. FEMS Yeast Reasearch 2015 (en prensa).
Mas A, Reguant C, Beltran G, Esteve B, Bordons A. Cepas autóctonas del Priorat de Saccharomyces, no Saccharomyces, y de bacterias lácticas, como inciadores de fermentación: proyecto europeo Wildwine. ACEnologia 2014. Disponible en https://www.acenologia.com/cepas_autoctonas_priorat_cor0914
Torija MJ, Rozès N, Poblet M, Guillamón JM, Mas A. Yeast population dinamics in spontaneous fermentations: Comparison between two different wine producing areas over a period of three years. Anton van Leeuwenhoek 2001; 79: 345-352.
